lscm880nlo激光扫描共聚焦显微镜的操作技能及应用

分析仪器AnalticalInstrumentationy

２０１９年第６期　

LSCM８８０NLO激光扫描共聚焦

显微镜的操作技能及应用

()曲阜２曲阜２１􀆰曲阜师范大学教学与设备管理中心,７３１６５;２􀆰曲阜师范大学生命科学学院,７３１６５

王玉花１∗　程　超１　杨　革２

的图像分析及在各领域的应用.同时根据公司培训和个人经验,介绍了该仪器在使用过程中的操作技能和注意事项,为大家在教学和科研中的应用提供技术参考.

:/DOI１０􀆰３９６９􀆰issn􀆰１００１－２３２x􀆰２０１９􀆰０６􀆰０２７j关键词:LSCM８８０NLO　操作技能　应用

摘　要:介绍了蔡司公司研发的L主要配置,软件功能,相应SCM８８０NLO激光扫描共聚焦显微镜的工作原理,

激光扫描共聚焦显微镜(　　目前,Laserscanning

,是一种多功能的高精confocalmicroscoLSCM)py

１Ｇ３]

,度荧光成像工具.该仪器在生命科学[化学以及]４,５

.如图１所示,材料科学等领域发挥着重要作用[

,矿石、陶瓷或者合金钢等不透光的材料)则需在主调节检测Detector列表下方的Reflection复选框,

PMT接受波长的范围使之覆盖激发光波长.注意,此时反射激光直接进入检测器PMT,调节通道扫描参数时需格外注意G防止信号过ain值的调节,强,保护检测器PMT.

/分光片下拉菜单中选择R并勾选８０T２０主分光片,

与传统荧光显微镜相比,LSCM的激发光在焦平面上投射均匀,所有的发射信号能被采集设备检测到;此外,以点光源代替场光源;而且LSCM在检测,器的前面配有P大部分的光会被Pinholeinhole屏XY扫描振镜.那些通过Pinhole的发射信号能被

光电倍增管(检测器接收,转化为数字信号PMT)并且传输至计算机,这样就会得到一副完整高清的共聚焦图像.如果需要拍摄反射光图像(比如测试

６,７]

;蔽掉[同时为了得到完成的图像,该仪器安装有

１　仪器配置(ZeissLSM８８０NLO)

光器.

拥有４个能提供近紫外及可见光波长范围的激

()激发波长４可检测A１０５nm的激光器:lexaＧ

４０５、DAPI和Hoechst等染料.

()激发波长４可２５８/４８８/５１４nm的激光器:()激发波长５可检测A３４３nm的激光器:lexaＧ５４６、C３和RFP等染料.y

()激发波长６可检测A４３３nm的激光器:lexaＧ６４７和C５等染料.y检测AlexaＧ４８８,CFP、GFP和FITC等染料.

检测器配有２个PMT通道和３２个高灵敏

图像具有６１GaAsP通道,４４×６１４４最大分辨率.

),另外配置５个物镜:１０X,２０X,４０X(water６３X().每个物镜都有P具有使样品厚度oillusＧDIC(

的微小差异转变为细微明暗差别,增强立体感的功.能)

该台仪器适用于观察细胞,组织切片、单晶的

图１　激光共聚焦扫描显微镜光路示意图

).几何形状以及合金材料的断面分析等(图２

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()()()()a􀆰细胞;b􀆰肝组织;c􀆰单晶;d􀆰合金钢

图２　激光扫描共聚焦显微图像

２　获取清晰图像方法

()激发光强度的选择１

激发光的选择是根据样品携带的荧光探针种类,如果样品为多种荧光染色,为了避免串色建议使用M应尽量不采ultiTrack模式进行信号采集,

集处于两种荧光物质发射光谱重叠部分的荧光信号.一般来说,增加激发光的强度会增加样品的荧光信号,但也会导致荧光淬灭或漂白;降低激发光的强度,过多地增大G将会降低信噪比,影ain值,响图像质量,或者采集不到较弱的信号.另外总是用高强度的激发光也会降低激发器的使用寿命,建议用低的激光强度,适当的增加Gain值.

())２Gain(Master

能改变图像Gain值表示施加在PMT上电压,

量的荧光图像.

Zoom值用来调节扫描区域的放大倍数.增加

选定区域的Z其图像会被放大.但Zoom值,oom值受物镜分辨率的限制,当大于５时,一般意味着图像无效放大,也就是说增大Zoom值不能得到相应的高清图像.另外,Zoom值的大小会影响扫描速度和图像清晰度,所以,在设置Z重新调oom值后,节FrameSize选项和扫描速度.

总之,为了得到高清的荧光图像,要根据采样

()扫描区域的调节５

要求及样品自身的条件,协调这些参数的设置.

３　激光扫描共聚焦显微镜的功能

３􀆰１　二维图像相关的常用视图

()１２D视图和Slit视图p

荧光信号的亮度和对比度.输入的Gain值越大,

图像呈现的荧光信号就越明PMT上的电压越高,

亮,但背景噪音也跟着增强.原则上为了增加信噪比,延长PMT的使用寿命,Gain值不大于８００.

()３DiitalOffsetg

通常设DiitalOffset的作用是调节图像背景,g

,如图３)此视图LSCM８８０NLO提供了Slit视图(p既能观察各单通道的荧光图像也可看到其叠加图像.借助此视图,通过调节各荧光通道的扫描参

８,９]

.数,能直观的观察各通道荧光强度的变化[

２D视图能提供预览和拍摄时的单通道的荧光

图像或者多通道的叠加荧光图像.此外,Zeiss

置为０.D采集到的图像iitalOffset的数值越小,g

背景越暗,但在降低背景的过程中,也会把样品中一些较弱的荧光信号当作背景消除掉.

()４DiitalGaing

DiitalGain值代表能对检测到的信号进行数g

或者适当增大激italGain值.也可增大pinhole值,

光强度等措施来得到满意的图像.当然,如果在目镜下较弱的荧光信号,在LSCM中是很难得到高质

而且又比较弱的样品荧光信号,如果Gain已经为

但荧光信号仍然较暗,可以选择适当调大D８００,iＧg

码放大的能力.通常设置为１.对一些必须采集的

图３　细胞的单荧光通道、DIC通道及对应的叠加图像

　１２０No．６Nov．２０１９

分析区域,之后,在Histo界面中即可显示所选区域的荧光强度直方图,荧光强分布数据以及平均荧光).强数据(如图４

()２Histo视图

在H用户可根据自己的需求选择isto视图中,

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荧光强度值变化不但会以曲线图的形式显示,而且还以表格的形式列出.此视图可用于分析药物刺激原生质体或者悬浮细胞在加药前后,某特定标记

]１２,１３

.物在细胞内外的分布[

图４　Histo视图及分析结果

(３)Coloc视图

对于多通道荧光图像,荧光信号单独表达的区域和Co共lo表c视图能直观显示

达的区域原始图

像,并用不同的伪彩标记出来[１０,１１]

以给出荧光共定位散点图和共定位.系C数olo(c界面可

如图在表达共定位时,对图像扫描参数的设置有严格的５).要求.首先,为了确保荧光信号的准确性,所选用的荧光信号之间不能发生信号串扰;其次,为了使像素点大小一致,保证两个荧光通道的在将多张具有共定位效果的荧光图像进行比较时FrameSize下的Optimal按钮Pinh;o第三le值一致,并点击,,需要拥有相同的扫描参数和阈值设定,这样共定位结果才具有可比性.

图５　Coloc视图及共定位系数

(４)Pro曲线上各点之间的荧光强度值变化rfiolfe视图

利用Pile视图,

可以分析图像中某一直线或(如图定好待测量的部位后,在Profile界面上所有通道的

６).在确图６　Profile视图及分析结果

３􀆰２　多维图像扫描

该软件给出的多维图像扫描方式常见的有:Stack、Timeseries、Reion和B.ZZ(１Ｇs)tZaＧgleachingcsktac扫描是指逐层连k扫描及３D视图

续收集过程,可以分析样Z轴方向上的一系列荧光图像的品的,目标分子在样品不同层面的分布等３信D立体结构息(如图O７a,b).需要扫描的图像数量(Slice

)可以点击(p的系统自动计算timal后的数字按钮,也可以自己设置浪费资源Interval值小于出步,又对真正O进p的ti(mIn３atDler值va,l否则会重复采样)).通常S自lic己e数量设,置既视图没有太大的贡献.３D视图可以提供多种三维重构模式(dTr,aen,sfpar)e,n其中cy,SMhaadximum和Surface.)(S如ha图do７cw,

,,o粒感的渲染方法来重构样本的表面结构Sw模式是通过投影衬托出有质

感的样品表面结构urface模式是指利用比较有颗,使图像看起来更有质感,能较好的突出样品的表面结构.因此上述两种模式常被用于材料样品的三维重构.T度ra,n而spMaraexnicmy模式下的D图像具有一定的透明um模式只３显示投射轴上最亮的像素点,因而这种模式下的这两种模式主要用于生３物D图像有较好的对比度.

样品的三维重构.此外C很深的球形orreia工作组用３D视图Clea１r４]

T光学清除法得到了穿透性

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图７　ZＧstack扫描及对应的３D视图

　　Ortho视图是ZＧstack扫描后能呈现的视图之一.在此视图中,ZＧstack图像以三维正交方式显视野内样品在X如图Z平面或YZ平面内的信息().８

示.用户可根据需求,移动X轴或Y轴,随时监测

,时间变化的曲线(如图９)并且将各时间点的平均荧光强度值或面积数据列在表格中.

图９　MeanROI视图及分析结果

()３Bleaching

在生物、医疗等领域中,当观察靶分子在细胞中的动力学过程时,常用B如leaching方法来完成,

图８　Ortho视图

１５,１６]

(.图１实验及光控蛋白的激活等[FRET)０为

该图能给出感FRAP实验获得的视图及分析结果,

荧光漂白后恢复(实验,荧光共振能量转移FRAP)

息随着时间的连续变化.在含有Timeseries信息的多维图像中,软件会提供MeanROI视图.该视

图可以提供研究区域内的平均荧光强度或面积随

()２Timeseries及MeanROI视图Timeseries扫描主要用于收集样品的荧光信

兴趣区域内的平均荧光灰度值随时间变化的趋势,而且激光漂白样品的时间点也会在变化曲线的时间轴上以白色标记标记出来.

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图１１　样品λstack扫描视图及λ曲线

图１０　FRAP实验获得的视图及分析结果

３􀆰３　光谱拆分

在实验过程中,如果不能避免选用发射光谱比较接近的荧光物质,或样品本身与加入的荧光物质的光谱有重叠,比如植物或动物的自发荧光对扫描

１７]

图像的干扰[等,使用常规的方法不能排除信号串

３􀆰３　Lambdamode扫描

在测试之前,如果不知道样品的激发光和发射光的波长范围,可事先通过目镜观察样品,找到感兴趣的视野对样品进行全光谱的L以ambda扫描,获得样品发射光在紫外和可见光范围内的强度度.根据该分布曲线可确定激发分布曲线(如图１１)光的选择和发射光的收集范围.当对样品的荧光图像进行光谱拆分时,也需对样品先进行Lambda扫描.之后软件才能根据相关设置完成光谱拆分.

扰的问题,从而可能出现假阳性结果.此时,可使用光谱拆分的方法,根据图像中各类荧光信号不同),的发射光波长谱线(如图１将其从多通道荧光２a,经过光谱拆分操作之图像中拆分出来.如图１２b后,不但能清晰的区分出发射光谱的收集范围,避免各通道间信号串扰的问题,而且能直观的观察到各个通道的荧光信息.

图１２　样品的光谱拆分曲线及对应的荧光图像

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４　结论

总之,根据样品的测试要求,合理的设置测试参数,利用激光扫描共聚焦显微镜不但能够得到合理的高清图像,还可以依据仪器配带的功能获得需要的分析结果.这些强大的功能致使LSCM成为生命科学,化学和材料科学等研究领域中重要的分析工具之一.结合LSCM分辨率低,激光存在荧光漂白作用和毒性等缺点,期望LSCM能与其他仪器连接从而使之能得到更广泛的应用.

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收稿日期:２０１９０３２６

:作者简介:王玉花:女,硕士研究生,实验师,１９７７年出生,EＧmailhxlwe＠１２６􀆰com,从事共聚焦显微镜的管理和测试.∗通讯作者