一株产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定

2011年3月JOURNALOFZHAOQINGUNIVERSITY

一株产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定

梁盛年

（肇庆学院生命科学学院，广东肇庆

526061）

摘要：从中国南方红豆杉三龄树树皮中分离得到内生真菌ZU07，经液体发酵，用高效液相色谱技术对该

真菌的发酵液提取物进行了分析，结果表明菌株ZU07能合成抗癌药物紫杉醇，其紫杉醇含量约为214．45μg蛐L．

关键词：中国南方红豆杉;紫杉醇;内生真菌;高效液相色谱法中图分类号：S459

文献标志码：A

文章编号：1009－8445（2011）02－0061－03

紫杉醇（Paclitaxel，商品名为Taxol）是迄今为止发现的最有效的抗癌药物之一．临床试验结果表明，紫杉醇对治疗妇科肿瘤（包括卵巢上皮癌和乳腺癌）效果较好，对其他肿瘤（如肺癌、前列腺癌、食道癌等）也显示出良好的治疗前景[1]．然而紫杉醇药源不足极大地了其在临床中的应用，开辟新的紫杉醇来源一直是国内外的研究热点．StrobelG[2]首次从短叶红豆杉（Taxusbrevifolia）中分离得到可产生紫杉醇的内生真菌，这一发现开辟了生产紫杉醇的新途径．其后，不断有文献报道从不同种的红豆杉树上分离出能产紫杉醇的内生真菌[3－8]，但那些红豆杉树的树龄均在几十年甚至百年以上，并且因生态环境不同，分离所得的内生真菌产出紫杉醇的能力亦不同，野生菌株产出紫杉醇普遍在200μg蛐L以下[9]．产率最高的是周东坡等[6]组建的一株工业菌株，产率为448．52μg蛐L，均未达到工业化生产的要求（工业化生产要求紫杉醇的产量要达到1mg蛐L以上）．本文中，笔者以生长在肇庆北岭山(地处北回归线带上，靠近广东著名的鼎湖山)的中国南方红豆杉（Taxusmairei）三龄树为材料，进行了产紫杉醇的内生真菌分离研究，旨在从中分离出高产率的产紫杉醇的内生真菌，以期为我国在世界上争取和利用微生物资源创造有利条件．

1

1．1

实验材料和实验方法

实验材料与设备

1)红豆杉：采自生长于肇庆北岭山的三龄中国南方红豆杉（Taxuschinensisvar．mairei）．2)培养基：根据需要采用固体和液体2种培养基．

分离时选用PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为6．8．配制方法是将马铃薯去皮切碎，水煮30min；用2～3层纱布过滤，溶入葡萄糖及琼脂后加水定容．在121℃的温度下灭菌20min，冷却至60～70℃时加入100mg蛐L氯霉素．斜面培养时培养基中不加入氯霉素．

发酵时选用PDA液体培养基：配制方法同上，不加入琼脂和氯霉素，分装至500mL三角瓶中，每瓶100mL，在121℃的温度下灭菌20min．

3)萃取液：乙酸乙酯－丙酮（体积比1∶1）．4)紫杉醇标准样：购自Sigma公司．

5)HPLC色谱仪：WatersTM600高效液相色谱仪，Waters2487检测器，Millenium32色谱管理系统（美国Waters公司生产）．1．2实验方法

1．2．1菌株分离方法

取三龄树的中国南方红豆杉的根、茎、叶片，先用自来水洗净；将茎的树皮剥下后切成1．0cm×

收稿日期：2009－06－15

作者简介：梁盛年（1973－）,男,广东肇庆人,肇庆学院生命科学学院实验师．

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肇庆学院学报第32卷

1．0cm的小方块，根和叶片则直接切成1．0cm×1．0cm的小方块，用无菌水洗净；然后浸入质量分数为75％的酒精中进行表面消毒，5min后取出，再用无菌水反复洗净后，置于装有PDA固体培养基的平皿中

央（每皿1块）；将平皿置于温度为28℃的培养箱中倒置培养3～4d，待长出菌丝后，挑取不同菌丝末端接种到新的PDA培养基平皿上；再于28℃的温度下培养3d，连续接代纯化(6～7次),即可得一纯菌株．最后在PDA斜面培养基上于28℃的温度下培养3d，置于冰箱保存．

ZU07菌株的液体培养

在500mL三角瓶中装入100mL液体培养基，灭菌、冷却后在培养基中接入斜面菌丝，在28℃的温度下用摇床培养7d，摇床速度为200r蛐min．1．2．3紫杉醇的提取与标准样品的制备

1)紫杉醇的提取：将发酵液以5000r蛐min的转速离心，取上清液于60℃的温度下旋转蒸发至1蛐10体积后，加入等体积的乙酸乙酯－丙酮（体积比1∶1）萃取2次，弃水相收集有机相；沉淀的菌体用组织捣碎仪处理后，经低温冻溶2次，加入一定量的乙酸乙酯－丙酮（体积比1∶1）萃取液用超声波细胞破碎仪处理15min，然后以5000r蛐min的转速离心；取上清液和前面的有机相液体混合于60℃旋转蒸发至干，残留

物用5mL的甲醇溶解，溶解液用5000r蛐min的转速离心10min，收集上清液过滤后保存备用．

1．2．2

2)标准样品的制备：将5mg紫杉醇标准品用甲醇溶解并定容至10mL，过滤备用．1．2．4

采用高效液相色谱技术检测真菌培养物中紫杉醇的含量

HPLC条件：XterraRP185μm柱（Waters公司生产），柱的规格为3．9mm×150mm，等浓度洗脱；流动相：甲醇－乙腈－水（体积比为25∶35∶40），流速为1．4mL蛐min；检测波长为227nm；进样量为20μL．

2

2．1

结果与分析

红豆杉树皮上微生物的类群及目的菌种的筛选

从南方红豆杉三龄幼树的根、茎、叶片分离得到23株内生真菌，分别以ZU01～ZU23编号标志

（其中ZU表示肇庆学院，01～23表示序号），其中有1株（编号为ZU07，从主茎树皮中分离得到）的孢子和——HU1353极为相似，因此选取ZU07作为主要研菌丝的显微结构与葛青平[10]所研究的紫杉醇产生菌—究对象．

2．2菌株ZU07的形态观察及分类定位

菌株ZU07在PDA培养基上于28℃的温度下培养，开始为白色，第3天变为褐色，第5天可生长到

6cm；背部呈黑色，无渗出液；菌落呈褐色，平展、致密；边缘整齐呈灰白色绒毛状，见图1．该菌株的菌丝

和分生孢子梗具横隔，菌丝多分枝，大小不一，见图2．分生孢子单生或连成链状，形状为卵形和倒棍棒形，壁呈砖状，光滑、具啄且有横隔，见图3～4．这些特征与半知菌亚门（Deuteromycotina）,丝孢纲（Hy-

phomycetes）、暗色孢科（Dematiaceae）、链格孢属[11]（Alternariaspp）的分类特征相吻合．此外，因与葛菁萍

等[10]从东北红豆杉中分离到的一新种红豆杉链格孢完全相同，故定位为红豆杉链格孢（Alternariataxi）．

图1ZU07菌落形态（培养7d）图2ZU07菌丝形态及孢子着生形态（400倍）

第2期梁盛年：一株产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定63

图3ZU07孢子形态（400倍）图4ZU07孢子及其孢子喙（400倍）

2．3高效液相色谱测定

采用高效液相色谱系统对ZU07发酵液提取物进行定性与定量检测，结果如图5所示．

上面为紫杉醇标准样品的HPLC图谱；下面为ZU07的HPLC图谱

图5

紫杉醇标准品和ZU07菌株HPLC图谱

由图5可见，ZU07发酵液提取物中含有与紫杉醇标准品UV图谱、Rt值较为接近的色谱峰，标准品

Rt值为3．702,而ZU07发酵液提取物为3．700，两者接近，表明ZU07发酵液提取物中含有紫杉醇类化合物的成分．根据峰的积分面积计算得出样品中紫杉醇的含量，再根据发酵液总量可计算出ZU07菌株液体

培养物中紫杉醇的质量浓度约为214．45μg蛐L，此为目前国内从红豆杉属树皮中分离出能产紫杉醇的菌株中产量较高的野生菌株，值得进一步深入研究．参考文献：

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（下转第83页）

第2期

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第25届亚洲男蓝锦标赛组委会.第25届亚洲男蓝锦标赛数据英雄榜[EB/OL].[2010-12-20].http://fiba/qq.com/oqasiamen/.

AnalysisonDefensiveAbilityBetweenChineseMen’sBasketballTeamandtheOpponentsinthe25th

AsianBasketballChampionship

ZHANGLichao1,ZHANGZhen2

(1.DepartmentofPhysicalEducation,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou,Guangdong510225,China;

2.CollegeofPhysicalEducationandHealth,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing,Guangdong526061,China)

Abstract:Byvideowatchinganddatastatistics,thedefensiveabilitybetweenChinesemen'sbasketballteamandtheopponentsinthe25thAsianBasketballChampionshipisanalyzed.It’sfoundoutthatthereof-tenspringsaleakwhendefendingtheplayerswiththeball,andthatthereisalittledistancewhendefendingtheplayerswithouttheballintheinside,duetothepoorprivityoftheplayers.It’salsofoundoutthatthecomprehensivedefensiveabilitiesofdefensiverebounds,stealsandblockaremuchweakerthanthatoftheopponents,andthattherearemorefaultsbutfewerdeliberatefaultsthanthatoftheopponents.

Keywords:The25thAsianBasketballChampionship;Chinesemen'sbasketballteam;defensiveability

（责任编辑：徐生然）

（上接第63页）

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IsolationandIdentificationofEndophyticFungus

AssociatedContainingTaxol

LIANGShengnian

(CollegeofLifeSciences,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing,Guangdong526061,China)

Abstract:AstrainofendophyticfunguswhichremarkZU07wasisolatedfromtheinnerbarkofthree-year-oldTaxuschinensisvar.mairei,byHPLCoftheculturefluidfromthefermentationoffungus,there-sultsshowedthatZU07couldsynthesizeanti-cancerdrugsofTaxol,itscontentwasabout214.45μg/L.

Keywords:Taxuschinensisvar.mairei;Taxol;endophyticFungus;HPLC

(责任编辑：陈静)