实验：一株紫杉醇内生真菌的分离与鉴定
不同的表面消毒方法和不同的培养基使得红豆杉内分离出来的内生真菌有其多样性，另外，由于红豆杉品种的不同，也可能使得实验结果出现一定的差异性．以下结合了中国红豆杉、南方红豆杉以及三尖杉的处理方法，来探讨从红豆杉内分离纯化内生真菌的方案，从而应用于实验室具体操作和取得最佳结果．如：采用化学法进行表面灭菌处理,运用平板涂布法及平板划线法得到内生真菌，然后利用分子鉴定法来鉴定菌种。
一． 材料及试剂
１.１材料：百年红豆杉的树皮样品，某年某月采于_______
１.２试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液,马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,蒸馏水100ml,lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液0.1g/l氯霉素或土霉素，0.05%吕氏碱性美蓝染色液,乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸，香草醛，紫杉醇标准品, １.３仪器设备：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，无菌剪刀或手术刀，无菌滤纸，细毛刷，恒温箱，电子分析天平，玻璃棒，纱布，试管或者锥形瓶，pH试纸，恒温箱，研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，胶头滴管，盖玻片，载玻片，镊子，光学显微镜，三角瓶，抽滤器，蒸发皿，分液漏斗，UF254硅胶板，电热鼓风干燥箱，喷壶，铅笔，直尺，毛细管，薄层板，层析缸，电吹风，酒精灯，镊子，紫外光灯，磨砂纸
二．实验操作 ２.１内生真菌的分离
２.１.1方法一：将树皮在洗衣溶液中浸泡３０min,并用细毛刷刷去表面污垢，然后在自然水中冲洗２０min.冲洗完成后转移至超净工作台上，用无菌滤纸吸干，放入７５％的乙醇中消毒３０s,然后用无菌水漂洗３次，再放入０.１％的升汞溶液中浸泡8min，取出后用无菌水漂洗４次．最后，用手术刀将树皮剪成０.５＊０.５cm小块，再放入事先准备好的PDA固体培养基平板中，２８℃恒温培养３－５d．每天观察一次，确定菌丝生长时间．等长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA斜面培养基上，２８℃下恒温保存．当菌落长满斜面后，划线接种于平板培养基上，每２d观察一次，根据菌落的形状颜色以及长出时间的不同，有不纯的菌落就要继续划线分离培养，直到得到纯种．将纯化后的菌株编号记下，接入PDA斜面培养基，于２８℃恒温培养６－７d后，保存于４℃冰箱。
((①无菌水使用量：前后共使用无菌水９次，大概需要？？ml无菌水；②乙醇制备：将100ml95%的酒精加蒸馏水至126ml后摇匀，即成75%的酒精，根椐C1V1=C2V2；③无菌水与蒸馏水：一般用实验室中的蒸馏水通过高温蒸汽法来灭菌即可得无菌水，无菌水水中的无机盐等一般来说不会减少．其温度指标和压力指标是？④升汞溶液制备：千分之一汞，1mL汞，汞的密度是13.6g/mL,用分析天平称取13.6g汞.⑤表面消毒检验：在材料是确定的情况下，肯定不会出现结果的“实验组”，我们称之为阴性对照，我们可以取最后一次无菌水冲洗液１００ul涂布到分离培养基下２８℃下培养１０d，观察消毒结果．注：如果未进行表面消
毒检验，没有作阴性对照实验组，在出现结果时，我们要注意以平板划线法来排除其它杂菌污染；此方法为平板划线法的具体操作，涂布平板法有所不同．)
(此过程所需试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液；此过程所需仪器：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，细毛刷，手术刀，无菌滤纸，恒温箱)
2.1.2方法二：组织研磨法，表面消毒方法同组织分离法，后将组织剪碎，置于研钵中充分研磨。以1: 10的比例加入无菌水，制备匀浆液，吸取100uL加入到分离平板中涂布。待菌丝长出后，挑取单菌落接种于PDA 固体培养基中。纯化结束后接种至试管斜面上，于4℃冰箱中保藏备用。 （此过程所需仪器：研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，试管；此过程中接种操作注意：选取边缘清晰又比较大的菌落，一环下去，能接触到菌落，记住不要插，轻轻碰一下就有几十万个菌，然后迅速转接到试管，整个过程不超过5秒。）
２．１.4注意操作：平板划线法与涂布划线法的区别
⑴涂布之后整个平板很均匀，划线操作不均匀，只有划线的地方有． ⑵涂布的前提是有菌液就能涂布，划线的前提是有菌落存在 ⑶涂布法简单，均匀，缺点是如果菌液密度大，不适合单菌落 ⑷划线操作麻烦，但能保证单菌落，分离纯化效率高． 2.2纯化内生真菌的方法-PDA培养基的制作方法
2.2.1培养基配制方法流程
1.洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可）
2.用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀
3.稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用
2.2.2注意事项
培养基经灭菌后，必须放在37C恒温箱培养24h，无菌生长的时候方可使用
PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol/LNaOH或1mol/LHCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养
培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性
(此步实验仪器：玻璃棒,纱布,试管或者锥形瓶,pH试纸,恒温箱) 2.3内生真菌的鉴定
2.3.1形态学鉴定法：肉眼观察，将分离纯化的内生真菌转接至PDA固体培养基上，于28℃培养7d观察，记录菌落大小、颜色、表面特征等;用透明胶带粘取菌丝并用美蓝染色制作临时装片；光学显微镜下观察，并拍照，记录菌丝、孢子和分生抱子梗形态等特征；参考【真菌鉴定手册】对分离菌株进行初步鉴定.
（此过程所需试剂：0.05%吕氏碱性美蓝染色液；此过程所需实验仪器：胶头滴管，盖玻片，载玻片，接种环，镊子，光学显微镜；制作临时装片注意：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型呈无色，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力。能使美蓝的蓝色氧化型变为无色的还原型。真菌有还原性，因此，具有还原能力的真菌是显蓝色的染液不宜过多或过少，否则，在加上盖玻片时，菌液会溢出而出现大量气泡而影响观察，在操作的过程中应慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，以免产生气泡而影响观察，最后滴好美蓝染液之后，接种菌种，然后在染色2-3分钟之后再加盖玻片在高倍镜下镜检。） 2.3.2薄层层析法：采用简单薄层层析的方法(TLC)进行检测，利用层析静相与流动相的原理，吸附力强的移动慢，吸附力弱的移动快，从而检测菌种液体培养的产物里是否含有紫杉醇。取0.03 g紫杉醇标准品，溶于60 ml甲醇中，配制成浓度为0.5 g/l紫杉醇标准品溶液。用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇按照体积比为88：7：5的比例配制展开剂按照甲醇:浓硫酸:香草醛体积比为90 ml:10 ml:1g的比例制成特异性显色剂，置于喷壶中检测方法:在层析片的一端1 cm处用铅笔和直尺画一直线，在直线上相隔0.5公分处均匀的点两个点作为标记；用毛细管吸取适量的紫杉醇标准品溶液和样品溶液，分别点在层析片标记处，试样点直径不能超过0.2公分，注意毛细管要换一根或用适当的方法清洗好再继续点样；点样完成后，将层析片置于装有0.2公分高的展开剂的展开槽中，铝铂纸加小烧杯作展开槽，然后在侧壁放一张润湿的长型滤纸，完全挥发之后
再使用镊子夹层析片放入展开槽中间，成斜立的状态，注意起始线必须高于展开剂的高度，当展开剂到达层析片前沿时取出，观察挥发情况，最后用铅笔划出前沿并标出试样点的位置和颜色，准备计算各点的RF值；当层析片上出现斑点，紫杉醇在特异性显色剂喷洒后会显示蓝色斑点，并测量斑点的Rf值
（实验试剂：三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸:香草醛，紫杉醇标准品
实验仪器：薄层层析片，镊子，毛细管，展开槽（可用铝铂纸加小烧杯），滤纸，展开剂，紫外光灯，磨砂纸，铅笔和直尺，酒精灯，喷壶 相关操作效果：紫外光灯：照射层析片从而看到实验结果；酒精灯：为了使毛细管在其外焰下加热，使毛细管氧化利于拉伸，再用磨砂纸从中折断；高极性的乙酸乙酯作为展开剂来使用，吸附力较高，轻易带动化合物上升，获得更好的分离效果；RF值的计算=化合物上升高度/展开剂前沿上升高度，注明展开剂比例） 2.3.3薄层层析硅胶板法
(1)摇床培养。将分离纯化的菌株分别接种到液体PDA培养基中，进行摇床振荡培养。摇床温度为27 °C，转速为180 r /min，避光培养，液体培养时间一般为12d
(2)液体培养物的提取。将三角瓶中的发酵液进行抽滤，抽滤后取上清液在50℃下进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10，加入相同体积的乙酸乙酯-丙酮(体积比为1：1进行萃取，萃取2-3次，收集有机相。将发酵液在50℃下旋转蒸发至液体蒸发完，残留物体用10 ml二甲醇溶解，在4℃冰箱中保存备用。
(3)提取物的检测。采用薄层层析的方法(TLC)进行检测，检测菌种液体培养的产物里是否含有紫杉醇。
①把UF254硅胶板在电热鼓风干燥箱中110℃活化30 min
②用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇按照体积比为88:7:5的比例配制展开剂。③按照甲醇:浓硫酸:香草醛体积比为90 ml:10 ml:1g的比例制成特异性显色剂，置于喷壶中。
取0.03 g紫杉醇标准品，溶于60 ml二甲醇中，配制成浓度为0.5 g/l紫杉醇标准品溶液。
⑤检测方法:在薄层板的一端1 cm处用铅笔画一直线，在直线上均匀的点几个点作为标记。用毛细管吸取适量的紫杉醇标准品溶液和样品溶液，分别点在薄层板标记处，点样完成后，将薄层板置于装有展开剂的层析缸中，展开时间为30 min，当展开剂到达薄层板前沿时取出。在烘箱中干燥薄层板后，用喷壶均匀喷洒特异性显色剂，喷洒完用电吹风加热，直至薄层板上出现斑点。紫杉醇在特异性显色剂喷洒后会显示蓝色斑点，并测量斑点的Rf值。
(实验试剂：液体PDA培养基，乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸，香草醛，紫杉醇标准品,
实验仪器：三角瓶，抽滤器，蒸发皿，分液漏斗，UF254硅胶板，电热鼓风干燥箱，喷壶，铅笔，直尺，毛细管，薄层板，层析缸，电吹风，酒精灯，镊子，紫外光灯，磨砂纸
注意：固体培养基是制平板、斜面、;斜面培养基用于菌种保存；液体培养基用于产试验细菌扩增培养，液体体培养基一般加入适当的凝固剂便可成固体培养基)
2.3.4分子鉴定法：18（or16）sRNA基因序列分析鉴定
