云南大学学报(自然科学版)
JournalofYunnanUniversity
1998,20(5):385～387CN53-1045/N ISSN0258-7971
一株产紫杉醇的内生真菌的分离及产物鉴定
张理珉 陆和生 游洪云 钱瑞雨
(云南大学生物系,昆明,650091;第一作者32岁,男,助理研究员)
①
摘要 从云南红豆杉树皮中分离得到内生真菌M11,经液体、固体发酵,用薄层层析法对该真菌的培养物、菌丝体提取物进行了分析,结果表明菌株M11能合成抗癌药物紫杉醇.关键词 紫杉醇,内生真菌,薄层层析分类号 Q93.5 紫杉醇(Paclitaxe,商品名Taxol)是从紫杉树
皮中分离提纯的天然产物.经临床试验结果表明,紫杉醇对治疗妇科肿瘤包括卵巢上皮癌和乳腺癌效果较好,对其它肿瘤如肺癌、前列腺癌、上胃肠道癌、白血病等也展示了良好前景.已于1992年底被美国FDA批准为抗晚期卵巢癌新药上市[1].目前研究生产紫杉醇的方法主要有四种:①从植物紫杉的树皮中提取;②半化学合成法;③植物细胞培养提取[2];④微生物方法培养提取[3,4].作者以云南丽江红豆杉为材料进行了产紫杉醇的内生真菌研究,对菌株的分离、纯化、培养、分离、产物的提取及检验等方法进行了探索.
的平皿上(每皿置三块树皮).将平皿于30℃培养箱中倒置培养3～4d后,挑得2株菌(M11,M3),并经多次在PDA培养基上30℃培养3d,确认无杂菌,再在PDA斜面培养基上30℃培养3d后,冰箱保存.
1.4 M11菌株的液体培养 500mL三角瓶中装入200mL液体培养基,灭菌,冷却后接入少量斜面菌
丝于培养基中30℃摇瓶培养72h.1.5 液体发酵及固体培养 将已培养好的液体种子以10%接种量分别接入液体发酵培养基中(再经30℃培养72h)和固体培养基(再经30℃培养168h).
1.6 紫杉醇的提取 参照文献[3]中的方法.1.7 紫杉醇的分析 采用薄层层析法[3].标样由
1 材料和方法
1.1 菌株 从云南省丽江地区的红豆杉(Taxus
chinensis(pilger)Rehd)树皮中分离得到.1.2 培养基 ①斜面培养及分离培养基:PDA培养基.②液体菌种培养基:马铃薯汁培养基(PDA
中科院昆明植物研究所提供.
2 结果与讨论
2.1 红豆杉树皮上微生物的类群 在用树皮分离
培养基中不加琼脂).③液体发酵培养基:A.马铃
薯汁培养基(PDA培养基中不加琼脂,葡萄糖用量为4%);B.葡萄糖8%,蛋白胨0.05%,酵母膏0.08%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.2%,MgSO4・7H2O0.05%.④固体发酵培养基:麦麸及少量无机盐.1.3 菌株分离方法 取红豆杉的树皮剪成约0.8cm×0.8cm大小的小块.浸入75%的酒精中进行表面消毒5min后取出置于装有PDA固体培养基
内生真菌时,细菌较少,是因为树皮表面已经过
75%的酒精短时间消毒,对细菌的影响较大,另外PDA培养基及培养温度不是细菌生长的最适条件,所以在分离时培养基上细菌较少.真菌以青霉和黑曲霉为多,但在较多的真菌中发现有两株(M11,M3)比较特殊的菌,均在树皮的周围长有棕褐色的菌丝,其周围的培养基也变成了褐色.在培养时发现M11长得快且好,因此选取M11作为主要研究对象.
①1998-02-03收稿
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云南大学学报(自然科学版) 第20卷
2.2 菌株M11的形态观察 菌株M11在PDA培养
基上30℃下培养1d后产生白色菌丝,菌丝生长较
快,紧贴于培养基上,第二天后白色菌丝开始变成褐色,第三天全部变成棕褐色.放入冰箱后过4～5d会在棕褐色菌丝上长出一些白色且很细的菌丝,呈绒毛状(见图1).在显微镜下观察,棕褐色菌丝与白色菌丝均多分枝,菌丝分隔,分枝的菌丝易出
芽形成椭圆形的结构(见图2),棕褐色菌丝较粗大,直径为10.0～14.0μm,白色菌丝较细小,直径4.0～5.0μm(见图3).这些形态特征基本上与北京大学生命科学院邱德有同志所分离的具有紫杉醇合成能力的内生真菌一致,只是在菌丝颜色上有差别.
图1 M11在PDA培养基上的生长形态(1为培养3d的形态,
2为在4℃下4～5d的形态)
Fig.1MorphologyofM11beingculturedonPDAmedium(1.be2
ingcultured3d,2.beingcontainedin4℃for4～5d)
图2 菌株M11出芽形成的结构(×300)
Fig.2ThestractureofthestrainM11(×300)
物质,菌体在生长过程中产生了某些酶类,使单宁氧化而变色,该菌在葡萄糖培养基中就基本不会使培养基变色.
附表 菌株M11液体发酵观察结果
Tab.ResultsofstrainM11liquidfermentation
培养时间32t/h72t/h
菌丝长得很多(+
培养基(3)A
++),培养基为褐
菌丝最多(+++
+),菌丝与发酵液
色,菌丝也呈褐色菌丝长得较多(+
图3 菌株M11的两种菌丝(×150)
Fig.3TwokindsofhyphalcellsofthestrainM11(×150)
均呈酱黑色菌丝较32h增多
(+++),培养基
培养基(3)B+),培养基颜色为
无色,菌丝白色
颜色为淡黄色,菌丝灰色2.3 M11菌株的液体发酵 将所分离得到的M11菌株在培养基(2)中30℃摇瓶培养72h分别接入培养基(3)A,B中进行培养,菌丝生长状况见附表.
该菌株经多次液体发酵表明:菌株在液体中生
2.4 菌株M11的固体发酵 将菌种接入固体培养
基中30℃培养24h后开始生长出白色菌丝,培养了7d,菌丝生长良好,呈白色.菌株在固体培养基中的生长要比液体培养基中好,这可能与菌株是从树皮中分离出来有关.内生真菌在树皮中存在,水分含量低,因此它要更适于固体培养基.
长缓慢,一般要3d才长好,有时接种量小些,液体
种子就长得不好.菌株在马铃薯液体培养基中培养最后变成酱黑色,可能是因为马铃薯中含有单宁类
第5期 张理珉等:一株产紫杉醇的内生真菌的分离及产物鉴定387
2.5 培养物的处理 1#样品:滤出在培养基(3)B中的菌丝体进行充分研磨.2#样品:将培养基(3)A的菌丝及培养液冷冻后进行充分研磨.3#样
品:将固体培养的培养基及菌丝体倒出,烘干后进行研磨.4#样品:将培养基(3)A的菌丝体滤出充分研磨.
上述4种样品均用等体积的氯仿和甲醇混合液(CHCl3∶CH3OH=10∶1v/v)萃取收集有机相,样品提取液在50～70℃下减压浓缩,残渣溶于少量甲醇中.
2.6 样品的薄层层析 用不同的展开剂对上述四
样品的Rf值如下.标准样品 Rf=0.79;1#样品
Rf1=0.91,Rf2=0.79,Rf3=0.21;2#样品 Rf1=0.91,Rf2=0.79,Rf3=0.65,Rf4=0.21;3#样品Rf1=0.47,Rf2=0.23;4#样品 Rf1=0.93,Rf2=0.79,Rf3=0.70,Rf4=0.63,Rf5=0.16.从上述两种不同展开剂的层析结果来看:菌株M11在上述液体培养条件下有产生紫杉醇的能力,且紫杉醇主要含在菌丝体内.
参 考 文 献1 俞天骥.紫杉醇———抗肿瘤新药.国外医学药学分册,
1993,20:72
2 甘烦远,郑光植.红豆杉的细胞工程学进展.国外医药植
种处理样品与标准样一起进行薄层层析,结果如下:
(1)展开剂为氯仿∶甲醇=7∶1v/v,各样品的Rf值如下.标准样品 Rf=0192;1#样品 Rf1=0191;Rf2=0.80,Rf3=0.71;2#样品 Rf1=0.91,Rf2=0.72;3#样品 Rf1=0.73;4#样品 Rf1=0.91.
(2)展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶9v/v,各
物药分册,1994,9(4):156
3 邱德有,黄美娟,方晓华,等.一种云南红豆杉内生真菌
的分离.真菌学报,1994,13(4):314
4 StrierleA.由短叶红豆杉的内生真菌生产紫杉醇和紫杉
烷.国外医药植物药分册,1995,10(1):13
IsolationandFermentationofEndophyticFungusAssociatedwithTaxus
ZhangLimin LuHesheng YouHongyun QianRuiyu
(DepartmentofBiology,YunnanUniversity,650091,Kunming,PRC)
Abstract EndophyticfungusM11wasisolatedfromthebarkofTaxusinYunnan.Byliquidandsolidfermetations,thecultureandfilamentextractionwereanalyzedbythinlayerchromatography.ItwasfoundthatstrainM11producedtheanti2cancerdrug2taxol.
Keywords taxol,endophyticfungus,thinlayerchromatography
33333333333333333333333333333333333
(上接第384页)
FungiFloraintheRhizosphereSoilofThreeSpeciesofPteridophytes
ShaTao ZhaoZhiwei ZhangHanbo
(DepartmentofBiology,YunnanUniversity,650091,Kunming,PRC)
Abstract Seventyeightfungalstrainswhichidentifiedto12generarespectivelywereisolatedfromtherhizospheresoilofthreeendangerouspteridophytes.ItwasfoundthatthefungithatbelongtoPenicillium,
FusariumandPseudobotrytiswerethecommonfungiintherhizospheresoilofthethreespeciesofpterido2
phytes,thedominantfungiwerevariedintherhizospheresoilofthethreespeciesofpteridophytes.
Keywords pteridophyte,rhizosphere,fungus
