生物材料溶血性标准化评价方法比较_溶血率法和氰化高铁血红蛋白法

生物医学工程学杂志

　2004;21(1)∶111～114　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

生物材料溶血性标准化评价方法比较:溶血率法和

氰化高铁血红蛋白法

张伶俐　朱蔚精　谭言飞　屈树新　张兴栋△

(四川大学分析测试中心生物学评价实验室,生物材料工程研究中心,成都　610064)

　　摘要　采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法(根据ISO󰃗TR7405)和氰化高铁血红蛋白法(根据ISO1099324)测定了羟基磷灰石(陶瓷)和胶原(高分子材料)的溶血性能,结果提示这两种方法的结论是一致的,且氰化高铁血红蛋白法较血红蛋白直接测定法有灵敏、稳定、可比性好等优点,值得推广应用。但它存在着一些标准中尚未明确规定的问题。作者在大量试验和不违背标准原则的基础上提出了一些改进意见,使它更具有可操作性,以便于标准化评价生物材料的溶血性能。

关键词　生物学评价　血液相容性　溶血试验

ComparisonbetweenHemolysisPercentageMeasurementandHemiglobincyanide

MeasurementforStandardizingtheEvaluationofHemolyticPropertiesofBiomaterials

ZhangLingli　ZhuWeijing　TanYanfei　QuShuxin　ZhangXingdong

SichuanUniversity,Chengdu　610064,China)

∃

(BiologicalEvaluationLaborotary,AnalysisandTestingCenter,EngineeringReseachCenterinBiomaterials,

　　Abstract　Inthisstudy,twomethods——thesupernatanthemoglobinspectrophotometry,i.e.hemolysispercentagemeasurement(accordingtoISO󰃗TR7405)andthehemiglobincyanidemeasurement(accordingtoISO

1099324)——wereusedtoassaythehemolyticpropertiesofhydroxyapatite(bioceramics)andcollagen(polymer).Theresultsshowedthattheconclusionsdrawnfromusingthetwomethodswerebasicallyconsistent,andthelat2terwasmoresensitive,stableandcomparable.However,someoftheproceduresinthehemiglobincyanidemethod.Sobasedonourexperiwerenotdefinedindetailsmentswehaveofferedsomesuggestionsandimprovements,whichdonotdeviatefromISOandASTMstandards,forhiherpracticabilityofusigitinstandardizingtheevalua2.Hemiglobincyanidemeasurementisworthyofwiderapplication.tionofthehemolyticpropertiesofbiomaterials

Keywords　Biologicalevaluation　　Hemocompatibility　　Hemolysistest

1　引　言

与血液直接或间接接触的生物材料必须评价它的血液相容性。溶血试验检测生物材料与红细胞的相互作用,是一项非常重要的血液相容性评价试验,也是一项重要的体外粗筛试验。目前国内外大多采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法评价生物材料的溶血性能[1～6],但国际标准化组织(Inter2nationalstandardorganization,ISO)于2000年颁布

[7]

了ISO󰃗DIS1099324:2000标准,重点推荐了氰化高铁血红蛋白法(hemiglobincyanide,HiCN),并指

∃联系人。E2mail:zhangxd@scu.edu.cn。Tel:028285412757

明操作程序参考ASTMF756293标准[8]。为了与国

际接轨,我国正在准备出台相应的等同标准(GB󰃗

[9]

T16886.42xxxx)。然而,无论是ISO󰃗DIS1099324:2000还是ASTMF756293都还有一些问题没有规定和说明,给这一标准的实施带来一定的困难。比如ASTMF756标准要求用3只兔的血分别进行试验,而ISO󰃗DIS1099324:2000要求最好用人血,也可以用三只兔的混合稀释血代替人血,因为动物血中兔的溶血性能与人最接近。其次,ASTMF756293和ISO󰃗DIS1099324:2000都没有规定无定形材料的检测用量,等等。本文对HiCN测定法进行了一些探索,重点分析了不同血液来源和不同材料的测定结果,比较了两种方法的优缺点,并且在不违背标准原则的基础上提出了一些建议,以便更好地贯彻实

112　　　生物医学工程学杂志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第21卷

施新颁布的标准(GB󰃗T16886.4)。

2　材料和方法

2.1　材料和仪器

选择了两大类生物材料。第一类是羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)生物陶瓷,白色颗粒状,51mm,其阴性对照选用氧化铝陶瓷,呈白色砂粒状。第二类是医用高分子胶原(collagen),白色片状,厚

度大于0.5mm,其阴性对照选用医用输血袋聚氯乙烯(Polychlorovinyl,PVC),无色透明片状,厚度小于0.5mm。新鲜兔血取自附有健康合格证的大耳白兔,人血取自某单位健康体检人群。可见与紫外分光光度计(UV755B型,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂制造,中国测试技术研究院检定)被用于本试验。

2.2　氰化高铁血红蛋白法(HiCN法)[7～10]

2.2.1　材料的准备　颗粒或砂粒状材料取1g放得游离血红蛋白浓度。

2.2.5　计算溶血指数(Hemolyticindex,H.I.)

1mL上清液中的游离血红蛋白.=H.I

1mL稀释血中的总血红蛋白

2.2.6　结果判断　溶血指数为0～2,不溶血;溶血指数为2～10,轻度溶血;溶血指数为10～20,中度溶血;溶血指数为20～40,明显溶血;溶血指数>40,重度溶血。

2.3　游离血红蛋白直接测定法[11～14]

2.3.1　材料的准备　颗粒或砂粒状材料取5g放

入一支试管中,洗涤方法同前。片状材料厚度大于0.5mm取30cm2(单面面积)放入一支试管中。阴性对照为生理盐水(0.9%NaClsolution,NS),阳性对照为蒸馏水,各取10mL装入一支试管中。材料、阴性对照、阳性对照各准备3只试管。

2.3.2　血液的准备　取一只健康家兔的鲜血2ml,肝素抗凝,加入2.5ml生理盐水稀释,0.2mL稀释血在10mL蒸馏水中于波长545nm处的吸光度值应为0.8±0.3。

2.3.3　材料与血液相接触　在3只装有样品的试管中每只加入10mL生理盐水,与阴性对照组和阳性对照组同时放入37±2℃恒温水浴中静置30min,加入0.2mL稀释血,再在37±2℃恒温水浴中静置1h。

2.3.4　吸光度的测定　取出上述试管,以700～800g离心5min。小心吸取上清液4mL,在紫外2可见分光光度计(UV2755B)上,用生理盐水调零,测

入一只试管中,蒸馏水洗3次,生理盐水洗3次,生理盐水浸泡5min,沥干备用。厚度大于0.5mm的片状材料取15cm2(单面面积),厚度小于0.5mm的取30cm2(单面面积)放入一只试管中。每种材料准备6个试管。

2.2.2　血液的准备　抗凝剂用肝素或ACD液(枸橼酸4.7g󰃗L,枸橼酸钠13.3g󰃗L,葡萄糖30.0g󰃗L)。兔血或人血的血浆游离血红蛋白浓度应小于1.0mg󰃗mL。用生理盐水稀释全血至总血红蛋白浓

度小于1.250±0.125mg󰃗mL。另外稀释三只兔的等量混合血,混合血的血浆游离血红蛋白和全血的总血红蛋白浓度均应满足上述要求。取稀释血1mL,加入3mLDrabkin’s试剂(碳酸氢钠1.0g󰃗L,氰化钾0.05g󰃗L,铁氰化钾0.2g󰃗L)中,测吸光度(OD540)值,即得1mL稀释血中的总血红蛋白。2.2.3　材料与血液接触　于每种材料6只试管中

定545nm波长下的吸光度(OD545)值,光径1cm。阴性对照组的吸光度的平均值为Dnc,阳性对照组的吸光度的平均值为Dpc,样品的吸光度为Dt。计算溶血率Z:

Z=

Dt-Dnc×100%

Dpc-Dnc

各加入5mL稀释全血,轻轻混匀。6只试管分成两组进行静态试验和动态试验。静态试验组在37±2℃恒温水浴中静置4h,动态试验组在37±2℃的条件下,置振摇板上振摇混合1h,垂直方向不超过45°,振摇频率为30±6r󰃗min。

2.2.4　吸光度的测定　取出上述试管,以700～800g离心5min,小心吸取上清液1mL,加入3mLDrabkin’s试剂中,在紫外2可见分光光度计(UV2755B)上,用Drabkin’s试剂调零,测定540nm波长下的吸光度(OD540)值,光径1cm。查标准曲线,即

2.3.5　结果判断　试验样品的溶血率应小于5%,

若大于5%则预示材料有溶血作用。

3　结　果

3.1　HiCN法检测羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶血指

数

首先测定了样品在不同兔血中的溶血指数(结果见表1)。证实不同个体的兔血对试验结果有影响。

第1期　　　　　　　　　　张伶俐等。　生物材料溶血性标准化评价方法比较:溶血率法和氰化高铁血红蛋白法

表1　HA颗粒与不同个体的兔血接触的HiCN法试验结果

Table1　TheresultsofHAincontactwithdifferentrabbitbloodbyHiCNmethod

MaterialsHA

Rabbits8#13#15#RabbitsHumanAHumanB

8#13#15#8#13#15#

Hemolyticindexofstatictest36.5±7.218.7±0.742.3±4.122.7±1.95.5±0.03.2±0.72.2±0.61.5±0.04.9±0.82.2±1.71.1±0.02.4±1.6orq14.4

F

P

113

Hemolyticindexofstatictest68.5±4.524.3±3.465.8±2.455.0±13.311.3±2.06.4±1.45.6±1.14.5±2.68.1±1.65.0±1.74.1±0.73.2±1.6orq54.2

F

P

<0.01<0.01

　①与③23.09　①与②18.95　②与③4.14

5.27

Al2O3

<<<<0.0.0.0.01010505

　①与③10.01　①与②8.48　②与③1.53

0.35<<>>0.0.0.0.01010505

NS0.25>0.057.22<0.05

②、③

　　注:①、是按三个组的溶血指数的均数从大到小排列,3HA:hydroxyapatite;HiCN:hemiglobincyanide

　　ISO󰃗DIS1099324:2000指出,最好选用人血做溶血实验,也可以用三只兔的混合稀释血液代替人血。因此本试验又测定了样品在8#、13#、15#兔的混合兔血(Rabbits)和人血A、B中的溶血指数(见表1)。结果说明即使将兔血混合在一起,仍与人血的试验结果有统计学上的差异,而且不同人的血液所得的试验结果之间亦具有统计学上的差异。

根据ASTMF756293,对混合兔血的试验结果进行评价,该批次的HA颗粒在动态条件下有明显溶血,在静态条件下有重度溶血。

3.2　游离血红蛋白直接测定法测定羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶血率

结果见表2。

表2　HA颗粒用游离血红蛋白直接测定法的试验结果

Table2　TheresultsofHAbysupernatantHbspectrophotometryMaterialsHANSH2O

Absorbance(OD545)0.672±0.0080.018±0.0020.775±0.019

Hemolysispercentage86.3%±1.00%

率,结果见表4。

表4　胶原用游离血红蛋白直接测定法的试验结果Table4　TheresultsofcollagenbysupernatantHbspectrophotometry

MaterialsCollagenNSH2O

Absorbance(OD545)0.264±0.0240.028±0.0020.805±0.027

Hemolysispercentage30.4%±3.17%

　　由此可以看出,两种溶血试验方法的结果是吻合的,都提示这批胶原材料有溶血作用。HiCN法的评价更进一步说明,这批胶原材料在动态条件下为轻度溶血,在静态条件下为中度溶血。

4　讨　论

目前标准化评价生物材料的溶血性能的试验方法主要有游离血红蛋白直接测定法和氰化高铁血红蛋白测定法。1978年美国ANSI󰃗ADA规定了游离血红蛋白直接测定法作为评价牙科材料溶血性能的方法,1984年,ISO󰃗TR7405284(E)正式推荐了此方法。我国对生物医学材料的评价起步较晚,缺乏溶血试验的评价标准。在80～90年代,我国陆续颁布了WS52121987《医用热硫化甲基乙烯基硅橡胶标准》、《口腔材料生物试验方法》、YY󰃗T0127.1293

《医用输液、输血、注射器具检验GB󰃗T14233.2293

方法》等标准,它们都采用了ISO󰃗TR7405284(E)的试验方法。在此基础上,目前很多生物材料溶血性能的检测也都使用游离血红蛋白直接测定法。然而HiCN法的优点亦不容忽视。1966年国际血液标准化委员会推荐氰化高铁血红蛋白作为国际标准方法。1978年国际临床化学联合会和世界病理学会联合发表的国际性文件中重申了HiCN法。1982年美国材料与试验协会(ASTM)在《医用材料和装置选择的一般生物学试验方法的实施标准》中推荐了

　　根据GB󰃗T14233.2293和YY󰃗T0127.1293标

准,本试验材料的溶血率为86.3%±1.00%,大于5%,提示材料有溶血作用。这与HiCN法所得试验结果相吻合。

3.3　两种方法检测胶原的溶血性能

(1)材料与混合兔血接触后,氰化高铁血红蛋白法测定胶原的溶血指数的试验结果见表3。

表3　胶原的动态和静态试验结果

Table3　ThedynamicandstaticresultsofcollagenbyHiCNmethodMaterialsCollagenPVCHemolyticindexofDynamictest

9.5±0.91.4±0.9

HhemolyticindexofStatictest

20.8±2.30.9±0.0

　　(2)游离血红蛋白直接测定法测定胶原的溶血

114　　　生物医学工程学杂志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第21卷

HiCN法,此后ISO1099324:1992将HiCN法作为

医疗器械的溶血试验评价方法,ISO󰃗DIS1099324:2000标准重点推荐了HiCN法。作者通过试验,发现HiCN法在实际操作中尚有一些标准中没有阐明的问题,由此,提出了一些建议。

(1)在稀释血液的准备过程中,ASTMF756293标准要求用3只兔的血分别进行试验,这样操作起来太复杂,由此带来的误差较大;而ISO󰃗DIS1099324:2000要求最好采用人血,如人血不容易得到,使用与人的溶血性能相近的动物血也是可行的。据报道[15],兔和人的红细胞有相同的溶血性能。因此ISO󰃗DIS1099324:2000规定也可以用3只兔的混合稀释血代替人血,并且最好这3只兔是同一血型。这在实际操作时仍较困难:其一,目前我国提供实验动物的单位还不能提供所售家兔的血型;其二,根据文献[16],家兔的血型系统(红细胞型)主要有H1、H2系,G、g系,K1、K2系和Hc系四种,市售用于的是,不可能对所有医疗器械及其应用规定一个统

一的合格与不合格的溶血量值。合格判定应根据风险与受益评价的一些形式来确定。当器械引起溶血时,必须确认该器械的临床受益,并且溶血是在临床可接受的限度内。比如本试验中检测的可作为凝血材料的胶原。

HiCN法较溶血率法有着不可忽视的优点:(1)从试验原理上来看,HiCN法较溶血率法更加灵敏和稳定,重复性也好。因为氰离子与血液红细胞中的铁离子结合非常迅速而完全,结合后形成的氰化高铁血红蛋白很稳定,在4℃下可以保存6个月之久,方便检测工作的留样和质量管理。而且采用HiCN法最大的优点就是可以自动化,并且使各个实验室(2)采用同种的阴性对之间的试验结果具有可比性。照材料而不是生理盐水,更加符合GB󰃗T16886.1222000的统一要求。(3)在材料与血液接触之前,测定血液的游离血红蛋白,筛除了自身有溶血的血样(可能是由于采血过程中红细胞损伤引起的)。而溶血率测定法则必须在试验结束后,视生理盐水组的溶血率是否大于0.03来判断结果的可靠性。(4)HiCN法既考虑到了静态条件下材料的溶血性能,又考虑

(5)结果评价按溶到了动态条件下材料的溶血性能。

血指数的大小进行了分级评价。

当然,HiCN法也有一些缺点。最大的缺点就是所用的试剂含有氰化钾,它在各种接触方式下都具有毒性。但是,只要在配液和操作过程中小心,采用次氯酸钠氧化法处理废液和用过的容器,就不会有危险。次氯酸钠遇氰离子时发生反应:5ClO2+2CN2+2OH2=2CO322+N2+5Cl2+H2O。

此外,HiCN法还较溶血率测定法操作更加复杂一些。但为了取得灵敏和稳定的结果,使各不同实验室之间的试验结果具有可比性,HiCN法值得推广应用。在入世以后将有大量的医疗器械和生物材料涌入我国,我国的生物材料也将亮相于国际市场。此时保持检测方法的标准化是极为重要的。

参

1

测定家兔血型的试剂少见,且测定每只家兔的血型还会增加实验方法的复杂程度和成本。作者将任意选择的三只健康兔的血等量稀释混合后未见明显的溶血和凝血现象,且经实验证明这种稀释混合血能够保证结果的准确性,也减少了不同兔的个体间的差异,是比较可行的。但这种稀释混合血与稀释人血相比仍有明显差异(P<0.01),即稀释混合兔血并不能完全等同于人血,同时考虑到标准化的试验方法应该是步骤少而误差少,笔者认为采用一只兔的血液是更加可行的。由此虽然不同的实验室可能得到不完全相同的溶血指数,但变异应该在同一等级(按溶血指数分为不溶血、轻度、中度、明显、重度溶血这五级)内,仍具有可比性。

(2)在材料的准备工作中,ASTMF756293和ISO󰃗DIS1099324:2000都没有规定无定形材料(如

颗粒和粉末)的检测用量,本试验采用了GB󰃗T16886.1222000推荐的无定形材料的浸提比例(0.1～0.2g󰃗5mL稀释血)来计算检测用量,mL,即1g󰃗

通过试验认为是适宜的可行的。

(3)在结果的评价方面,ASTMF756293规定,溶血指数0～2为不溶血;2～10为轻度溶血;10～20为中度溶血;20～40为明显溶血;>40为重度溶血。参照ASTMF981286的评价方法,即5级评价分类中前两级均认为是可以接受的,因此认为若溶血指数<10就可以认为材料通过了评价。应该注意

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