玉米蛋白去酰胺改性的研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 搏和饲料工２００７，Ｎ０．４　田　ＡＬ＆ＦＥＥＤＩＮＤＵＳＴ　ＲＹ　ＣＥＲＥ玉米蛋白去酰胺改性的研究　李红梅　，侯立琪　，马兴胜　（１．上海理工大学食品与生物技术研究所，上海学食品工程研究所，黑龙江哈尔滨摘１５０００１）　２０００９３；２．北京晟都食品有限责任公司，北京１０１５００；３．哈尔滨商业大　要：酸法去酰胺作用能改变玉米蛋白的结构和乳化性能，考察了反应时间，盐酸浓度以及反应温度对反应的影响。结果表　明：反应时间８　ｈ。温度６０％，盐酸浓度０．０５—０．１　ｍｏｌ／Ｌ为较好的反应条件，在此条件下能有效的抑制蛋白水解，去酰胺度达到　２８．６％，对应改性蛋白的乳化活性和－ｉ＇Ｌ＇ｌ￣稳定性从原始蛋白的８．２　ｍ　／ｇ和３２％提高到２６．７　ｍ２／ｇ和７４．５％。随去酰胺程度的　增大，玉米蛋白的表面疏水性和分子柔性先增加后趋于平衡，但去酰胺作用并未造成玉米蛋白￣－ｚＥ，键的断裂或形成。　关键词：去酰胺；玉米蛋白；乳化活性；表面疏水性；分子柔性　中图分类号：ＴＳ２０１．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—６２０２（２００７）０４—００１９—０３　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｍｏｄｉｉｃａｔｉｆｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｒｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　Ｄｅａｍｉｄａｆｉｏｎ　ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｍｕｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　ｃｏｒｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｂｅ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ－ＨＣ１　ｃｏｎ・　ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｎｄｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　８　ｈ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ－６ｏ℃ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　０．０５～０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣ１－ｔｈｅ　ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　２８．６％－ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＥＳＩ　ｆｒｏｍ　８．２　ｍ　／ｇ　ｔｏ　２６．７　ｍ　／ｇ－ａｎｄ　ＥＳＡ　ｆｒｏｍ　３２％ｔｏ　７４．５％ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ｆａｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ＣＯｒｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｒｅｎｄｅｄ　ｔｏ　ｂａ１．　ｎｃｅ　ｗｉｔａｈ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ。ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｏｒ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ＣＯｒｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＳ．　ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ；ＣＯｒｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＳＩ；ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ：ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ｆａｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ　现代食品工业的飞速发展急需大量既能作为主料又能　作为辅料的功能性蛋白质，而大部分的天然蛋白质在食品加　工工业中功能特性的表现尚不突出，尤以玉米蛋白最为严　１实验材料与方法　１．１实验材料　玉米蛋白：自制，其组成成分为蛋白质９２．１％，水分　１．５％，碳水化合物０．９％，粗纤维５．９％，粗脂肪０．６％。色　拉油：深圳南海油脂有限公司生产的金龙鱼牌色拉油。其他　试剂均为分析纯或生化试剂。　１．２实验方法　重，这就极大限制了其行使蛋白质功能特性的能力。食品蛋　白质化学的研究已充分表明，可通过化学改性的方法改善蛋　白质的功能性质ｕ。Ｊ。因为蛋白质的侧链有很多种类的基　团，在这些基团上增加或减少某种功能性基团，在一定程度　上能改变蛋白质的功能特性。目前应用于改变蛋白质侧链　基团的方法有酰基化改性、去酰胺改性、糖基化改性、磷酸化　改性、烷基化改性、亲脂化改性　。其中，去酰胺改性是使　蛋白质分子中的羰基上Ｏ一和Ｈ　直接发生质子化作用，生成　羧酸根离子　Ｊ。由于去酰胺形成羧酸根离子，引起氢键的减　１．２．１玉米蛋白酸法去酰胺改性实验　将５　ｇ的玉米蛋白，分散在１００　ｍｌ的一定浓度的盐酸溶　液中，采用磁力搅拌器进行搅拌，在一定的温度下反应一定　时间后，取一定量的蛋白溶液进行改性程度和乳化性能的测　定。　少和静电排斥的增加，导致蛋白质的空间构象发生变化。从　而增加蛋白质的溶解度，有利于功能特性的提高。　玉米蛋白富含大量酰胺氨基酸，如天门冬酰胺和谷氨酰　胺，其中谷氨酰胺含量约占总氨基酸的１／３　’　。有资料表　踢即使很小的去酰胺作用，也能使蛋白质的功能性质发生显　著提高　。因此本研究拟通过酸法对玉米蛋白进行去酰胺　１．２．２玉米蛋白去酰胺改性程度的测定　Ｃｏｎｗａｙ法　ｏ　脱酰胺程度（ＤＤ）＝（样品去酰胺产生的氨÷样品完全　去酰胺产生的氨）×１００％　１．２．３玉米蛋白乳化性能的测定　（１）乳化活性的测定　改性，期望通过去酰胺作用能提高玉米蛋白功能特性，从而　改善玉米蛋白长期应用于饲料工业的现状，拓宽玉米蛋白在　食品工业如乳制品、肉类、饮料、焙烤工业等的应用范围，解　决玉米深加工中大宗副产品的出路问题，提高产品的附　加值。　用不同ｐＨ值，浓度０．０１　ｍｏＬ／Ｌ磷酸缓冲液配制成质量　分数０．５％的蛋白样液，取４０　ｍｌ色拉油和８Ｏ　ｍｌ待测液在胶　体磨中均质１　ｍｉｎ，用微量进量器取１００　ｌ，用含０．１％ＳＤＳ　的相同的磷酸缓冲液稀释成１０　ｍｌ，立即用７２１分光光度计　在５００　ｎｍ波长下测定其吸光值Ｅ。　收稿日期：２００６一¨一１４；修回日期：２００７—０３—１３　作者简介：李红梅（１９７５一），女，讲师，从事蛋白质工程、食品生物技术专业的研究工作。　维普资讯 http://www.cqvip.com 圈　乳化活性指数ＥＡＩ：　Ⅱ，Ｊ　李红梅等：玉米蛋白去酰胺改性的￣／２００７年■４■　×稀释倍数　而增大，但通过对不同时间获得的改性玉米蛋白乳化性能的　测定发现（图２），在反应进行到８　ｈ，ＤＤ达到２８．６％时，乳　式中，ＥＡＩ为每克蛋白的乳化面积，ｍ　／ｇ；　为油相所占的分　数，本实验为１／３；Ｃ为蛋白质的质量分数，本实验为０．５％；，　为比色池的光径，１０　ｍｍ。　（２）乳化稳定性的测定　将用上述方法制得的玉米蛋白乳化液在７０￣Ｃ条件下，恒　温加热半小时，也用同样的方法测定其乳化活性指数。　１．２．４　去酰胺度与蛋白表面疏水性关系　化活性和乳化稳定性同时达到最大值２６．７　ｍ　／ｇ和７４．５％，　８　ｈｉＪ），后开始下降。由此可见，改性程度存在一个最佳值，在　此条件下玉米蛋白的乳化性能提高幅度最大，对此可能的原　因是在长时间的低酸性条件下，玉米蛋白在去酰胺的过程中　将部分发生水解，生成一些疏水性的小分子多肽，不利于蛋　白质功能特性的提高。　２．２盐酸浓度对玉米蛋白改性的影响　玉米蛋白样品悬浮于０．１　ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中（ｐＨ值　在酸法去酰胺的过程中，过高的盐酸浓度会引起蛋白质　７．０），在高速均浆机上均质（１０　０００　ｒ／ｍｉｎ，２　ｍｉｎ），离心　（３　０００　ｒ／ｍｉｎ，２０　ｍｉｎ），上清液用同一磷酸缓冲液按一定梯　度稀释后加入ＡＮＳ溶液（１．６　ｍｌ，６　ｍｏｌ／Ｌ）测定Ｐｒｏ—ＡＮＳ溶　液的荧光强度。Ａ．＝３９０　ｎｍ，Ａ　＝４７０　ｎｍ，以荧光强度对蛋　白浓度作图，曲线开始的斜率为蛋白的表面疏水性。　１．２．５去酰胺度与蛋白分子柔性关系　在４　ｍｌ蛋白质质量分数０．１％，ｐＨ值为８．０的　０．０５　ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液中加入２５０　ｐＬ１质量分数　０．１％的胰蛋白酶溶液，在３８℃水解一定的时间后添加４　ｍｌ　的质量分数４％三氯乙酸去除未水解蛋白，用滤纸过滤，滤液　用Ｌｏｗｒｙ法测定其中水解肽和氨基酸的含量，用水解度的大　小表征蛋白质分子柔性增加或减少。　１．２．６去酰胺度与蛋白巯基、二硫键含量的关系　Ｅｌｌｍａｎ试剂法　。　２实验结果与讨论　２．１　玉米蛋白去酰胺反应进程分析　为了对酸法改性玉米蛋白的反应过程有较全面的认识，　保持其它参数（蛋白质质量分数５％，０．０８　ｍｏｌ／Ｌ盐酸、　５５￣Ｃ，反应体积２５０　ｍ１）不变，测定了玉米蛋白去酰胺的反应　进程曲线，如图１、图２所示。　萏　岛　时『日】，ｈ　图１　反应时间对玉米蛋白去酰胺度的影响　时问，ｈ　—ＥＡＩ　＿＿＿ＥＡＳ　图２　反应时间对玉米蛋白乳化性能的影响　从图１可以看出，玉米蛋白去酰胺度随反应时间的增加　肽键的急剧水解，因此有必要考察盐酸浓度对玉米蛋白改性　的影响，其结果如图３、图４所示。　ＨＣＩ浓度／ｍｏｌ・Ｌ－。　图３　盐酸浓度对玉米蛋白去酰胺度的影响　—－　—－ＥＡＩ　－１－－ＥＡＳ　ＨＣＩ浓度／ｍｏｌ　Ｕ。　图４盐酸浓度对玉米蛋白乳化性能的影响　从图３和图４可以看出，去酰胺度（ＤＤ）随盐酸浓度的　增加而增加，但乳化活性与乳化稳定性在０．０ｌ～０．１０　ｍｏｌ／Ｌ　盐酸浓度范围内是随盐酸浓度的增大而增大，当盐酸浓度超　过０．１０　ｍｏｌ／Ｌ时，玉米蛋白的乳化活性与乳化稳定性开始降　低。Ｋａｔｏ等　曾报道过高的盐酸浓度不仅引起肽键的急剧　水解，且将产生某些副反应和异构化反应，不利于提高蛋白　功能特性。因此，在０．０５～０．１　ｍｏｌ／Ｌ这样一个酸性环境条　件下进行改性，将有利于玉米蛋白保留蛋白质大分子结构以　行使乳化功能。　２．３温度对玉米蛋白改性的影响　温度是影响蛋白去酰胺的条件之一，去酰胺一般在较高　的温度下进行，这样能增加玉米蛋白的溶解性，从而加快反　应的进行　，图５、图６表明了温度对玉米蛋白改性的影响。　从图５、图６中可以看出，去酰胺度随反应温度的增高相　应增加，但乳化活性和乳化稳定性起初随温度的升高而升　高，在６０￣Ｃ时达到最高，之后随着温度的升高而降低。对此　的解释可能是玉米蛋白在长时间高温度下发生严重的不可　逆变性，不利于得到功能特性优良的改性蛋白。　２．４去酰胺度对表面疏水性和分子柔性的影响　表面疏水性和分子柔性是表征蛋白质构象变化的重要　维普资讯 http://www.cqvip.com 李红梅等：玉米蛋白去酰胺改性的研究／２Ｏｏ７年■４啊　参数之一。图７是去酰胺度与玉米蛋白表面疏水性和分子柔　性的关系。从图７＇９７以看出，去酰胺作用能改变玉米蛋白　表面疏水性和分子柔性，不过，去酰胺作用对表面疏水性的　石口　影响大于对分子柔性的影响。　图５　墨　一。一ＥＡＩ　一￣－ＥＡＳ　温度／￣Ｃ　图６温度对玉米蛋白乳化性能的影响　＊　撂　暄　鞯　－Ｑ－－表面疏水性一－一分子柔性　ＤＤ，％　图７去酰胺度与蛋白表面疏水性和分子柔性的影响　对表面疏水性而言，随去酰胺度的增加，表面疏水性先　增加后趋于平衡，且增加幅度比较大。当去酰胺度大于３５％　后，玉米蛋白的表面疏水性基本趋于平衡，达到一个最大值　３６０左右。尽管分子柔性变化幅度不大，但当去酰胺度达到　３５％后，玉米蛋白的分子柔性也几乎趋于平衡。究其原因可　能与蛋白质的螺旋结构有关。当去酰胺度达到一定值时，蛋　白质的螺旋结构展开趋于稳定，也就是说玉米蛋白的螺旋结　构存在一定的稳定区域，当达到稳定时，蛋白质的表面疏水　性和分子柔性将不再发生变化。　２．５去酰胺度与蛋白巯基、二硫键含量关系分析　在酸法去酰胺改性的过程中，巯基、二硫键的相互转变　也会引起蛋白分子构象发生变化，从而影响蛋白质乳化性能　的改变，因此考察了去酰胺度和蛋白巯基、二硫键含量的变　化情况，如图８所示。　从图８中可看出，随去酰胺程度的增加，巯基、二硫键间　的相互转化并不明显，说明本实验采用的酸法去酰胺是一种　温和的改性方法，并未破坏玉米蛋白中二硫键，也未促使玉　米蛋白分子内或分子间巯基形成二硫键。　■　－二硫键・巯基　Ｄ　％　图８玉米蛋白去酰胺度与二硫键、巯基含量的影响　３结论　去酰胺作用可改变玉米蛋白的空间结构从而改善玉米　蛋白的乳化性能。过长的反应时间、过高的盐酸浓度以及反　应温度均将抑制玉米蛋白乳化性能的提高。随去酰胺程度　的增大，玉米蛋白表面疏水性和分子柔性先增加后趋于平　衡，但在去酰胺过程中，玉米蛋白分子内或分子间的二硫键、　巯基的相互转化并不明显。　［参考文献］　［１］王璋，许时婴，汤坚．食品化学［Ｍ］．第一版．北京：中国轻　工业出版社，１９９９．　［２］　陈伟斌．大豆分离蛋白改性研究进展［Ｊ］．粮食与油脂，２００６，　４（３）：７８～９０．　【３］张锐昌，徐志宏，刘邻渭．小麦蛋白改性技术的研究进展［Ｊ］．　粮食与饲料工业，２００６（２）：２５～２８．　［４］周海梦，王洪睿．蛋白质化学修饰［Ｍ］．第一版．北京：清华大学　出版社，１９９８．　［５］　Ｒｉｈａ　ＷＥ，Ｉｚｚｏ　ＨＶ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｈｏ　ＣＴ．Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｅ　Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆＦｏｏｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｆｏｏｄ　Ｓｅｉ　Ｎｕｔｒ，１９９６，３６（３）：２２５　～２５５．　［６］Ｓｕｈ　Ｈ　Ｊ，Ｗｈａｎｇ　Ｊ　Ｈ，Ｓｕｈ　Ｄ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　Ｉ　Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆｒｏｍ　Ｃｏｒｎ　Ｇｌｕｔｅｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００３，３８：１　２３９～１　２４４．　１　７］Ｄｏｍｂｒｉｎｋ—Ｋｕｒｔｚｍａｎ　Ｍ　Ａ，Ｂｉｅｔｚ　Ｊ　Ａ．Ｚｅｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈａｒｄ　ａｎｄ　Ｓｏｆｔ　Ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ　ｏｆ　Ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ，１９９３，７０（６）：　１０５～１０８．　［８］潘家秀．蛋白质化学研究技术［Ｍ］．上海：科学出版社，１９６８．　［９］Ｐｅａｒｃｅ　Ｋ　Ｎ，Ｋｉｎｓｅｌｌａ　Ｊ　Ｅ．Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅ・　ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｉｆｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，　１９７８，２６（３）：７１６～７２３．　【１０］Ｙｉｌｄｆｉｍ　Ｍ，Ｈｅｔｔｉａｒａｃｈｃｈｙ　Ｎ　Ｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｏｌｙ　Ｍｅｒｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｒｏｓｓ—－ｌｉｎｋｉｎｇ　Ｗｈｅｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　Ｓｏｙ　Ｂｅａｎ　１　１Ｓ　Ｇｌｏｂｕ—　ｌｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ，１９９６，６１（６）：１　１２９～１　１３１．　［１　１］　Ｋａｔｏ　Ａ，Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｋ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ　Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｓｕｓ—　ｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ　Ａｓｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，１９８５，３３（５）：９３１～９３４．　［１２］　Ｅｌｌｍａｎ　ＧＩ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｓｕｌｔｈｙｄｒｙｌ　Ｇｒｏｕｐｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ—　ｐｈｙｓ，１９５９，８２（５）：７０～７７．　［１３］　Ｋａｔｏ　Ａ，Ｔａｎａｋａ　Ａ，Ｍａｔｓｕｄｏｍｉ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐＨ［Ｊ］．Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，　１９８７，３５（７），２２４～２２７．　［１４］马兴胜，侯立琪，李红梅．小麦面筋蛋白的改性技术［Ｊ］．哈尔　滨商业大学学报版，２００１，１７（２０）：２ｌ～２２．　（责任编辑：黄小平）