蛋白-细胞核蛋白提取方法

蛋白-细胞核蛋白提取方法(总

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提取细胞核蛋白的步骤：

1. 向培养细胞的平皿中加入少量（保证在 TUBE内能放下）冷PBS(或1*D-Hanks) 2. ，用细胞刮刀尽可能多的刮下细胞，收集到的离心管中。

在预冷的离心机中，４度，1000rcf，1－3分钟，沉降细胞。 为尽可能多的获得细胞，可将一次离心后的上清再重复刮细胞一次； 2. 将细胞重悬于cell lysis buffer中（加入体积106细胞/200uL，体积估计方

法还是没确定,should be sufficient; 一般就是一个10cm平皿加1ml cell lysis buffer）,添加蛋白酶抑制剂；先破细胞膜，得到细胞核（没有用B DOUNCE）；

冰上放置（不震荡，可偶尔用枪轻吹）30分钟至1小时（此时核膜没有破，有核染色为证），充分裂解；

cell lysis buffer：

5mM PIPES pH 85mM KCL, % NP40, 1% protein inhibitor;

3. ４度，1000rcf，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检

测，建议先浓缩一下），沉淀为细胞核；

此时可以将沉淀冻存于－70℃； 4. 将沉淀重悬于100-200 ul nucleai lysis buffer（体积视目的蛋白表达丰度

而定，一般50-100ul）中，添加蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清；

nucleai lysis buffer：成分同SDS lysis buffer；

50mM Tris-Cl pH , 10mM EDTA, 1% SDS, 1% protein inhibitor;

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5. 四度，最大转速离心，10分钟以上（尽可能沉淀完全），上清即为细胞核蛋白；

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