食品安全检测综合实验

一、实验目的

1． 通过本实验的学习，使学生了解测定食品中胆固醇的意义。 通过本实验的学习，使学生了解测定食品中胆固醇的意义。

2． 通过本实验的学习，使学生掌握紫外－可见分光光度检测方法。

二、实验内容

1． 样品制备。 样品制备。

2． 分光光度法检测。

三、实验要求

采用集中授课形式组织教学。 采用集中授课形式组织教学。

四、实验准备

1． 样品制备及操作。 样品制备及操作。

2． 紫外－可见分光光度仪的使用方法。 紫外－可见分光光度仪的使用方法。

五、实验原理、方法和手段

1． 实验原理 实验原理

当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合发应，当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合发应，产生有颜色的物质。可脱水并发生聚合发应，产生有颜色的物质。据产生有颜色的物质。据此可先对食品样品进行提取和皂化，而后用硫酸铁铵试剂作为显色剂，测定食品中胆固醇的含量。 胆固醇的含量。

2． 实验方法和手段 实验方法和手段

食品样品的制备，分光光度计的使用。 食品样品的制备，分光光度计的使用。

六、实验条件

1． 主要仪器 主要仪器

A． 电子天平（1/10000） B． 电热恒温水浴 电热恒温水浴 C． 电动振荡器 电动振荡器

D． 具塞比色管：10 mL、25 mL E． 吸量管：2.0 mL 2． 试剂 试剂 A.  石油醚 石油醚 B.  无水乙醇 无水乙醇 C.  浓硫酸 浓硫酸

D.  冰乙酸：优级纯 冰乙酸：优级纯 E.  磷酸 磷酸

1 

F.  胆固醇标准物质 胆固醇标准物质

G.  胆固醇标准液。胆固醇标准储备液（1 mg/mL）：准确称取胆固醇100 mg，溶

100 mL。此溶液至少在2个月内保持稳定。胆固醇标准使于冰乙酸中，并定容至100 mL

用液（100 ：吸取胆固醇标准储备液10 mL，用冰乙酸定容至100 mL。 此mg/mL）液用时临时配制。 液用时临时配制。 H.  铁矾显色剂。铁矾储备液：溶解4.463 g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2•H2O]于100 mL 85％磷酸中，贮于干燥器内，此液在室温下稳定。铁矾显色液：吸取储备液10 mL，用浓硫酸定容至100 mL，贮于干燥器内，以防吸水。 ，贮于干燥器内，以防吸水。 I.  氢氧化钾溶液（500 g/L）：称取50 g氢氧化钾，用蒸馏水溶解，并稀释至100  mL。

J.  氯化钠溶液（50 g/L）：称取5 g氯化钠，用蒸馏水溶解，并稀释至100 mL。 K.  钢瓶氮气：纯度99.99％ 3.  测定食品 测定食品 食品。 食品。

七、实验步骤

1． 胆固醇标准曲线 胆固醇标准曲线

吸取胆固醇标准使用液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分别置于10 mL比色管内，在各管内加入冰乙酸使总体积皆达4 mL。沿管壁加入2 mL铁矾显色液，混匀，在混匀，在15 min～90 min内，在560 nm～575 nm波长下比色。用胆固醇标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线。 吸光度值为纵坐标做标准曲线。 2． 样品处理 样品处理

食品样品用索氏提取法提取脂肪，并计算出每100 g食品中的脂肪含量。将提取的油脂3滴～4滴（约含胆固醇300 mg～500 mg），置于25 mL比色管内，准确记录其质量。加入4 mL无水乙醇和0.5 mL500 g/L氢氧化钾溶液，在65℃恒温水浴中皂化1 h。皂化时每隔20 min～30 min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出比色管，冷却。加入3 mL 50 g/L氯化钠溶液，氯化钠溶液，10 mL石油醚，盖紧玻塞，在电动振荡器上振摇2 min，静置分层（一般约需1 h以上）。 3． 样品中胆固醇的测定 样品中胆固醇的测定 取上层石油醚液2 mL，置于10 mL比色管内，在65℃水浴中用氮气吹干，加入4 mL冰乙酸，2 mL铁矾显色液，混匀，放置15 min后在在560 nm～575 nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。 长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。 4． 测定结果的计算 测定结果的计算 按下式计算： 按下式计算：

A´V1´c1X= ´V2´m1000式中： ）； 式中： X-----试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100 g

A-----测得的吸光度值在胆固醇标准曲线上的胆固醇含量，单位为微克

2 

（mg）；

V1----石油醚总体积，单位为毫升（ml）； V2----取出的石油醚体积，单位为毫升（ml）； m----称取的食品油脂试样量，单位为克（g）； c-----试样中油脂含量，单位为克每百克（g/100 g）。

八、思考题 九、实验报告

1． 预习报告 预习报告 2． 实验记录 实验记录

试样中油脂含量c= 

称取的食品油脂试样量m= 

测得的吸光度值在胆固醇标准曲线上的胆固醇含量A= 

3． 实验报告 实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。 写。

十、注意事项及其它说明

1． 实验前要清点仪器，如果发现缺少应按规定手续项试验准备室领取，实验仪器若有损坏亦应按规定换取新仪器。 器若有损坏亦应按规定换取新仪器。

2． 实验时应保持安静，认真操作，仔细观察实验现象，如实记录试验结果，积极思考问题。 极思考问题。

3． 实验时应按正确的操作法进行，注意安全 实验时应按正确的操作法进行，注意安全

4． 实验过程中应保持地面及桌面的整洁。废纸、废液、金属屑等应投入废纸篓或废液桶中，严禁投入或倒入水槽内，防止水槽或下水道堵塞和腐蚀。 或废液桶中，严禁投入或倒入水槽内，防止水槽或下水道堵塞和腐蚀。

5． 实验时要爱护公物，小心使用仪器或设备，注意节约用水、电、药品。使用仪器时应严格按操作规程进行，如果发现、仪器时应严格按操作规程进行，如果发现、仪器有故障应立即停止使用，及时报告仪器有故障应立即停止使用，及时报告指导教师。 指导教师。

6． 实验完毕应将玻璃仪器洗涤干净，放回原处，整理好桌面，打扫干净水槽和地面。 地面。

7． 实验结束后必须关闭电源、水龙头并关好门窗。 实验结束后必须关闭电源、水龙头并关好门窗。

3 

实验二：食品中六六六、滴滴涕残留量的测定 实验二：食品中六六六、滴滴涕残留量的测定

一、实验目的

1． 通过本实验的学习，使学生掌握食品中有机氯农药残留的测定方法。 通过本实验的学习，使学生掌握食品中有机氯农药残留的测定方法。 2． 通过本实验的学习，使学生掌握气相色谱仪的使用方法。 通过本实验的学习，使学生掌握气相色谱仪的使用方法。

二、实验内容

1． 试样制备。 试样制备。

2． 气相色谱测定。 气相色谱测定。

三、实验要求

采用集中授课形式组织教学。 采用集中授课形式组织教学。

四、实验准备

1． 样品制备及操作。 样品制备及操作。 2． 气相色谱操作方法。 气相色谱操作方法。

五、实验原理、方法和手段

1． 实验原理 实验原理

试样中六六六、滴滴涕经提取、净化后用气相色谱法测定，与标准比较定量。电子捕获监测器对于负电极强的化合物具有极高的灵敏度，利用这一特点，可分别检测出痕量的六六六、滴滴涕。不同异构体和代谢物可同时分别测定。 检测出痕量的六六六、滴滴涕。不同异构体和代谢物可同时分别测定。 2． 实验方法和手段 实验方法和手段

食品样品的制备，气相色谱仪的操作。 食品样品的制备，气相色谱仪的操作。

六、实验条件

1． 主要仪器 主要仪器

A． 电子天平（1/10000）

B． 气相色谱仪：配有电子捕获监测器 气相色谱仪：配有电子捕获监测器 C． 植物组织粉碎机 植物组织粉碎机 D． 调速多用振荡器 调速多用振荡器 E． 离心机 离心机

μmμm，有机系 F． 微孔滤膜：0. 45 ，有机系

2． 试剂 试剂 A． 丙酮 丙酮 B． 正己烷 正己烷

C． 石油醚（沸程30℃～60℃） ℃） D． 浓硫酸 浓硫酸

4 

E． 氯化钠 氯化钠

F． 农药标准品：六六六，纯度>99％；滴滴涕，纯度>99％。 ％。

G． 农药标准储备液：精密称取六六六、滴滴涕标准品（a-HCH，b-HCH，g-HCH

2.5 mg，溶于正和d-HCH以及 p,p’-DDE，o,p’-DDT，p,p’-DDD和p,p’-DDT）各2.5 mg

己烷中，分别移于25 mL容量瓶中，以正己烷稀释至刻度，混匀，浓度为200 mg/L，贮存于冰箱中。 贮存于冰箱中。 H． 农药混合标准工作液：分别量取上述各标准储备液于同一个25 mL容量瓶中，以正己烷稀释至刻度。a-HCH，g-HCH和d-HCH的浓度为0.005 mg/L，b-HCH和p,p’-DDE浓度为0.01 mg/L0.01 mg/L，o,p’-DDT浓度为0.05 mg/L0.05 mg/L，p,p’-DDD浓度为0.02 mg/L，p,p’-DDT浓度为0.1 mg/L。 3.  测定食品 测定食品

蔬菜或水果：圆白菜、小白菜、草莓、小西红柿。 蔬菜或水果：圆白菜、小白菜、草莓、小西红柿。

七、实验步骤

1．试样的制备与提取 ．试样的制备与提取

100 g，加适量水（圆白菜、小白菜称取具有代表性的样品（蔬菜或水果）约100 g

等蔬菜加水150 mL，草莓、小西红柿等水果加水50 mL），于植物组织捣碎机中捣碎，混匀。准确称取匀浆15.0 g左右于150 mL磨口锥形瓶中，加20 mL丙酮，将锥形瓶置于振荡器中振荡30 min，加氯化钠3 g，摇匀。用吸量管准确加入石油醚15.0 mL，再振荡30 min。静置分层，取上清液5.0 mL转移至10 mL塑料离心管，小心缓慢滴加0.5 mL浓硫酸净化，振摇0.5 min，于3000 r/min离心10 min，用针管取少量上层清液，经管取少量上层清液，经0.45 mm有机系滤膜过滤后收集到小试剂瓶中，供气相色谱法分析用。 法分析用。

2．气相色谱测定 ．气相色谱测定

毛细管柱气相色谱条件：载气：高纯氮，流速1 mL/min,尾吹，；柱尾吹，25 mL/min温：185℃；检测器温度225℃；进样口温度195℃。进样量为2 mL。或采用程序升温，90℃（1 min）——40℃/min——170℃——2.3℃/min——230℃（17 min）——40℃/min——280℃（5 min）；检测器温度300℃；进样口温度280℃。与标准比较定量。 较定量。

3． 测定结果的计算 测定结果的计算

试样中六六六、滴滴涕的单一含量按下式进行计算。 试样中六六六、滴滴涕的单一含量按下式进行计算。

AX=1A2´m1´f m2式中： X--------试样中六六六、滴滴涕的单一含量，单位为毫克每千克（mg/Kg）； A1------被测定试样各组分的峰面积； 被测定试样各组分的峰面积； A2-------各农药组分标准的峰面积； 各农药组分标准的峰面积；

m1-------单一农药标准溶液的含量，单位为纳克（ng）； m2-------被测定试样的取样量，单位为克（g）；

5 

f---------测定试样的稀释倍数。 测定试样的稀释倍数。

八、思考题

1． 在本实验中为什么要选用电子捕获检测器？ 在本实验中为什么要选用电子捕获检测器？ 2． 实验操作中影响最后测定结果的因素有哪些？ 实验操作中影响最后测定结果的因素有哪些？

九、实验报告

1． 预习报告 预习报告 2． 实验记录 实验记录

被测定试样各组分的峰值A1= 

各农药组分标准的峰值A2= 单一农药标准溶液的含量m1= 被测定试样的取样量m2= 被测定试样的稀释倍数f= 3． 实验报告 实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。 写。

十、注意事项及其它说明

1． 注意事项参见实验一。 注意事项参见实验一。

6 

实验三：电子鼻在酒类品牌鉴别中的应用 实验三：电子鼻在酒类品牌鉴别中的应用

一、实验目的

1． 通过本实验的学习使学生了解电子鼻的实验原理。 通过本实验的学习使学生了解电子鼻的实验原理。

2． 通过本实验的学习使学生掌握测定酒类的操作及建立的模板方法。 通过本实验的学习使学生掌握测定酒类的操作及建立的模板方法。 二、实验内容

1． 将样品注入顶空瓶中静置。 将样品注入顶空瓶中静置。 2． 测定样品。 测定样品。 3． 建立模版 建立模版 4． 辨别样品 辨别样品

三、实验要求

采用集中授课形式组织教学 采用集中授课形式组织教学

四、实验准备

仪器实验参数的调整及预备操作。 仪器实验参数的调整及预备操作。

五、实验原理、方法和手段

1． 实验原理 实验原理

电子鼻的十个金属氧化物传感器在与酒类样品中的主要成份乙醇、水，微量成分有机酸、酯、羰基化合物和芳香族化合物等物质作用时改变了传感器的电导率。这些传感器获得的信号与样品的化学成分相关，并且与先前存储的模型文件进行比较，即可实现辨别酒类样品的目的。 型文件进行比较，即可实现辨别酒类样品的目的。 2． 实验方法和手段 实验方法和手段

样品注入顶空瓶中静置、测定样品、建立模版及样品辨别等操作。 样品注入顶空瓶中静置、测定样品、建立模版及样品辨别等操作。 六、实验条件

1． 主要仪器 主要仪器

A．EN3便携式电子鼻 便携式电子鼻 B．微量进样器10ul C. 顶空瓶30ml 2． 试剂: 酒类样品 酒类样品

七、实验步骤

1  设置电子鼻PEN3参数 参数

参数选择：Sample intenal  1.0s；Flush time 60s；Zero point time 10.0s；

7 

presampling time 5.0s；Measurement time 60s；Chamber flow (ml/min)260；initial injection flow (ml/min)260 。

2  测定样品 测定样品

用微量进样器量取一号酒样5ul注入顶空瓶中，静置60s。电子鼻屏幕上出现进样提示时，将通气针插入顶空瓶顶端再将进样针插到顶空瓶上，此时仪器自动进样，测量完毕保存实验数据，每次测量后要对传感器进行清洗。如上重复操作测定“二号、三号、四号”样品。 如上重复操作测定“二号、三号、四号”样品。 3  建立模板 建立模板

选择数据点范围31秒---40秒，选中数据组“一号、二 秒，选中数据组“一号、二 号、三号、四号”样品分别打开Apply 完成后，输入模板名称→确定。 完成后，输入模板名称→确定。 4  调用模板 调用模板 辨别样品 辨别样品 5  截取视图 截取视图 八、思考题

1、在测定样品时为什么要保持在相同条件的测试条件下进行 、在测定样品时为什么要保持在相同条件的测试条件下进行 2、在建立模板时应注意哪些条件才能使模板有效 、在建立模板时应注意哪些条件才能使模板有效 九、实验报告 九、实验报告 1、预习报告 、预习报告 2、实验记录 、实验记录 3、实验报告 、实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。

十、注意事项及其它说明 十、注意事项及其它说明

1、实验前必须对所做实验进行预习，提交预习报告。 、实验前必须对所做实验进行预习，提交预习报告。

2、进入实验室必须穿白大褂，不得大声喧哗，不准在实验室吃东西。 、进入实验室必须穿白大褂，不得大声喧哗，不准在实验室吃东西。 3、严格按照老师要求动手操作，确保实验过程安全。 、严格按照老师要求动手操作，确保实验过程安全。

备注： 电子鼻使用说明

1  电脑与电子鼻连接 电脑与电子鼻连接

开始→WinMuster→Options→Search devices→PEN3→OK 

2  设置电子鼻PEN3参数 参数

Options→PEN3→Settings→Control 3  建立模板（PCA部分） 部分）

any” →选择数据点范 Files→Pattern→Edit Pattern→Add Messdatei→Extract Date“any”

围（--  --）秒→Pattern name→Add→选中数据组中样品数据打开→Apply→全部完

save as→输入模板名称→确成后close→Ok→PCA→F5→保存模板（file→pattern→save as

8 

定） 定）

4  调用模板 调用模板 辨别样品 辨别样品

file→pattern→loud→选中模板→PCA→F5→打开已测定的文件→辨别样品。 5  截取视图 截取视图

Copy Window→程序→附件→画图→将被测图样写入标记→保存→ View→Copy Window

复制到Word文件中。 文件中。

9 

实验四：食品中苯甲酸和山梨酸含量的测定

一、实验目的

1． 通过本实验的学习，使学生掌握苯甲酸和山梨酸的检测方法。 通过本实验的学习，使学生掌握苯甲酸和山梨酸的检测方法。 2． 通过本实验的学习，使学生掌握高效液相色谱的操作技术。 通过本实验的学习，使学生掌握高效液相色谱的操作技术。

二、实验内容

1． 样品制备。 样品制备。

2． 液相色谱测定。 液相色谱测定。

三、实验要求

采用集中授课形式组织教学。 采用集中授课形式组织教学。

四、实验准备

1． 样品制备及操作。 样品制备及操作。

2． 高效液相色谱仪的使用方法。 高效液相色谱仪的使用方法。

五、实验原理、方法和手段

1． 实验原理 实验原理

不同样品经提取后，将提取液过滤，不同样品经提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分离测定，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分离测定，根据保留经反相高效液相色谱分离测定，根据保留时间定性，以峰面积与标准比较定量。 时间定性，以峰面积与标准比较定量。 2． 实验方法和手段 实验方法和手段

食品样品的处理，高效液相色谱仪的操作。 食品样品的处理，高效液相色谱仪的操作。

六、实验条件

1． 主要仪器 主要仪器

A． 电子天平（1/10000）

B． 高效液相色谱仪：配有紫外检测器 高效液相色谱仪：配有紫外检测器 C． 离心机：转速不低于4000 r/min。 D． 超声波清洗器 超声波清洗器 E． 恒温水浴箱 恒温水浴箱 F． 微孔滤膜：0.45 μm，水系；0.22 μm，水系。 ，水系。 2． 试剂 试剂

A． 甲醇：色谱纯 甲醇：色谱纯 B． 高纯水 高纯水

C． 乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵，加水稀释至1000 mL，经微孔滤膜过滤。 ，经微孔滤膜过滤。 D． 氨水（1+9）：按体积比一份氨水与九份水混合。 ：按体积比一份氨水与九份水混合。 E． 亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6•3H2O]，加水至100 mL。

10 

F． 乙酸锌溶液：称取22.0 g乙酸锌[Zn(CH3COO)2•2H2O]，溶于少量水中，加入3 mL冰乙酸，加水稀释至100 mL。 G． 标准溶液配制： 标准溶液配制：

① 苯甲酸标准储备液：准确称取苯甲酸标准储备液：准确称取0.1000 g苯甲酸，加水溶解，加入少量氢氧化钠溶液，加水定容至100 mL。此溶液每毫升含苯甲酸1.00 mg。 ② 山梨酸标准储备液：准确称取山梨酸标准储备液：准确称取0.1000 g山梨酸，加水溶解，加入少量氢氧化钾溶液，加水定容至100 mL。此溶液每毫升含山梨酸1.00 mg。 ③ 混合标准使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸和山梨酸标准储备溶液，将其稀释成苯甲酸和山梨酸的含量分别均为0.020 mg/mL和0.080 mg/mL的混合标准溶液。 液。

3.  测定食品 测定食品

饮料、果冻、番茄酱等。 饮料、果冻、番茄酱等。

七、实验步骤

1． 样品处理 样品处理

① 含有胶基的果冻样品：将样品捣碎，用小烧杯称取1 g样品（精确至0.001 g），加少量水（约10 mL），转移至25 mL容量瓶中，再加水至约15 mL，置于65℃水浴

30 min，取出后趁热超声5 中片刻，加塞，剧烈振摇使其分散均匀后再于65℃水浴30 min

min，待冷却后定容至刻度，用待冷却后定容至刻度，用0.45 微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶mm微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶中待上机分析。 中待上机分析。

② 番茄酱样品：用小烧杯称取1 g样品（精确至0.001 g），加少量水（约10 mL），

15 mL，加塞，振摇使其分散均匀后置于65℃转移至25 mL容量瓶中，再加水至约15 mL

水浴30 min，取出待冷却后用水定容至刻度，用定性滤纸和漏斗过滤后收集滤液，滤液再用0.45 微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶中待上机分析。 mm微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶中待上机分析。

③ 含蛋白质较多的乳饮料样品：用小烧杯称取10 g样品（精确至0.001 g），转移至25 mL容量瓶中，加入2 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2 mL乙酸锌溶液，

50 mL塑料离心管中，4000 r/min4000 r/min摇匀，以沉淀蛋白质，加水定容至刻度，转移至50 mL

10 min，取上清液用0.22 mm微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶中待离心10 min

上机分析。 上机分析。

10 g样品（精确至0.001 g0.001 g）5 min除去④ 碳酸饮料样品：用小烧杯称取10 g，超声5 min

容量CO2，用少量氨水（1＋9）溶液（约3～5滴）调节pH至近中性，转移至25 mL

瓶中，加水定容至刻度，用0.45 mm微孔滤膜过滤，滤液收集到干燥的小试剂瓶中待上机分析。 待上机分析。

2．液相色谱条件： ．液相色谱条件：

m，或性能相当者； ① 色谱柱：C18柱，250 mm×4. 6 mm，5 µ，或性能相当者；

② 流动相：甲醇+乙酸铵溶液（5+95）； ③ 流速：1.2 mL/min； ④ 检测波长：230 nm；

L。 ⑤ 进样量：20 µ

11 

L注入高效液相色谱仪进行分离，取处理液和混合标准使用液各20 µ以其标准

溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中被测物质含量，供计算。 溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中被测物质含量，供计算。 3． 测定结果的计算 测定结果的计算

试样中苯甲酸或山梨酸的含量按下式计算获得： 试样中苯甲酸或山梨酸的含量按下式计算获得：

A1´c´VX=

A2´m式中： ； 式中： X------试样中待测组分的含量，单位为克每千克（g/kg）

A1-----试样中待测组分的峰面积； 试样中待测组分的峰面积； A2-----标准使用液中该组分的峰面积；

c------标准使用液中该组分的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

V------样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m------试样的质量，单位为克（g）。

八、思考题

1． 与气相色谱法相比，液相色谱法的优点和缺点各是什么？ 与气相色谱法相比，液相色谱法的优点和缺点各是什么？

2． 本实验中影响最后测定结果的因素有哪些？如果小烧杯中的样品未完全转移至容量瓶，测定结果与真值相比会有如何变化？ 至容量瓶，测定结果与真值相比会有如何变化？

九、实验报告

预习报告2． 1． 预习报告 实验记录 实验记录

试样的质量m= 

试样中待测组分的峰面积A1= 

标准使用液中该组分的峰面积A2= 标准使用液中该组分的浓度c= 样液最终定容体积 样液最终定容体积 V= 

3． 实验报告 实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。

十、注意事项及其它说明

1． 注意事项参见实验一。

12 

实验五 实验五 紫外分光光度法测定茶叶中咖啡碱含量 紫外分光光度法测定茶叶中咖啡碱含量

一、实验目的 一、实验目的

1、进一步熟悉紫外分光光度计的结构和使用方法 、进一步熟悉紫外分光光度计的结构和使用方法 2、掌握一种茶叶中咖啡碱的提取与测定的方法 、掌握一种茶叶中咖啡碱的提取与测定的方法

二、实验内容 二、实验内容

1、沸水提取茶叶中咖啡碱，减压过滤，酸性条件下醋酸铅沉淀叶蛋白和茶多酚。 2、紫外分光光度计的基本结构及使用方法。 、紫外分光光度计的基本结构及使用方法。 3、标准曲线定量方法的应用。 、标准曲线定量方法的应用。

三、实验要求 三、实验要求

采用集中授课形式组织教学。 采用集中授课形式组织教学。 四、实验准备 四、实验准备

1、有机化学的蒸馏装置及操作。 、有机化学的蒸馏装置及操作。

2、仪器分析紫外分光光度计结构及原理。 、仪器分析紫外分光光度计结构及原理。 3、紫外光谱的定量方法。 、紫外光谱的定量方法。

五、实验原理、方法和手段 五、实验原理、方法和手段

1、实验原理 、实验原理

茶叶中的咖啡碱易溶于水。在茶叶水浸出物中除去叶蛋白、茶多酚等物质后，留下的生物碱其测定波长为274nm者，均称为茶叶咖啡碱。 者，均称为茶叶咖啡碱。 2、方法和手段 、方法和手段

沸水提取茶叶中咖啡碱，减压过滤，酸性条件下乙酸铅沉淀叶蛋白和茶多酚。日本岛津公司UV2501PC紫外分光光度计测定，标准曲线法定量。 紫外分光光度计测定，标准曲线法定量。

六、实验条件 六、实验条件

1、主要仪器 、主要仪器

UV2501PC型紫外分光光度计（日本岛津），电子天平（感量0.0001g），恒温水浴。 水浴。

2、试剂 、试剂

碱性乙酸铅（AR）溶液：称取50g碱性乙酸铅，加水100mL，静置过夜。 ，静置过夜。 盐酸（AR）0.01mol/mL溶液：取0.9mL盐酸，用水稀释1000mL，摇匀。 ，摇匀。 硫酸（AR）9mol/mL溶液：取硫酸250mL，用水稀释至1000mL，摇匀。 ，摇匀。

咖啡碱（光谱纯）标准液0.5mg/mL：称取100mg咖啡碱（纯度不低于99%）

13 

溶于100mL蒸馏水水中，作为母液，准确吸取作为母液，准确吸取1.25mL加蒸馏水定容至25mL作为工作液（1mL含咖啡碱0.5mg）。

七、实验步骤 七、实验步骤

1、样品制备 、样品制备 称取3g（准确至0.001g)左右磨碎茶叶试样（600-1000目）于500mL锥形瓶中，加沸蒸馏水450mL，立即移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min摇动一次）。浸提完毕后立即趁热减压过滤。滤液移入500mL容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2-3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。 次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。 2、测定 、测定

用移液管准确吸取试液提取液20mL至入250mL容量瓶中，加入10mL0.01mol/ml盐酸和2mL碱性乙酸铅溶液，用水准确稀释至刻度，充分摇匀，静置澄清过滤。准确吸取滤液50mL，注入100mL容量瓶中，加入0.2mL 9mol/mL硫酸溶液，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤。用10mm石英比色池，在波长274nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。 3、咖啡碱标准曲线的制作 、咖啡碱标准曲线的制作

分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL咖啡碱工作液（0.5mg/mL）于一组10mL容量瓶中，各加入容量瓶中，各加入0.4mL盐酸溶液，用水稀释至刻度，混匀，盐酸溶液，用水稀释至刻度，混匀，用用水稀释至刻度，混匀，用10mm石英比色池，在紫外分光光度计，波长为274nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。将测得的吸光度与对应的咖啡碱浓度绘制标准曲线。 。将测得的吸光度与对应的咖啡碱浓度绘制标准曲线。 4、 结果计算 结果计算

计算方法和公式 计算方法和公式

茶叶中咖啡碱含量，以干态质量百分率表示，按下式计算： 茶叶中咖啡碱含量，以干态质量百分率表示，按下式计算：

C  250  100 

——×———— ——× ——× L1 ——×————

1000  20  50 

咖啡碱（%）=——————————————×100  M×m C——根据试样测得的吸光度式中：（A），从咖啡碱标准上查得的咖啡碱相应含量，

mg/mL；

L1——试液总量，mL； M——样品用量，g；

m——试样干物质含量百分率。 ——试样干物质含量百分率。

八、思考题 八、思考题

1、样品提取时应注意什么？为什么要趁热过滤？ 、样品提取时应注意什么？为什么要趁热过滤？ 2、如何确定被测物质的检测波长？ 、如何确定被测物质的检测波长？ 3、简述紫外分光光度计的基本结构。

14 

九、实验报告 九、实验报告

1、预习报告 、预习报告 2、实验记录 、实验记录

样品重量：M=  试样干物质含量百分率：m=  试液总量：L1=  试样含量：C= 

咖啡碱系列标准溶液吸光度值 咖啡碱系列标准溶液吸光度值 2 4 8 12 

浓度Cs 

（μg/mL） 咖啡碱AS λ=275nm 

0 16 

样品溶液AX

3、实验报告 、实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。 写。

十、注意事项及其它说明 十、注意事项及其它说明

1． 注意事项参见实验一。 注意事项参见实验一。

15 

实验六：水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 实验六：水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定

一、实验目的

1． 通过本实验的学习，使学生掌握鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验方法。 隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验方法。 2． 通过本实验的学习，使学生掌握液相色谱-串联质谱的使用方法。 串联质谱的使用方法。

二、实验内容

1． 样品制备。 样品制备。

2． 液相色谱-串联质谱测定。 串联质谱测定。

三、实验要求

采用集中授课形式组织教学。 采用集中授课形式组织教学。

四、实验准备

1． 样品制备及操作。 样品制备及操作。

2． 液相色谱-串联质谱仪的使用方法。 串联质谱仪的使用方法。

五、实验原理、方法和手段

1． 实验原理 实验原理

试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后用液相色谱-串联质谱法测定。 联质谱法测定。

2． 实验方法和手段 实验方法和手段

食品样品的处理，液相色谱-串联质谱仪的操作。 串联质谱仪的操作。

六、实验条件

1． 主要仪器 主要仪器

A． 电子天平（1/10000）

B． 高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 ）离子源。 C． 离心机：转速不低于4000 r/min。 D． 超声波水浴 超声波水浴 E． 匀浆机 匀浆机

F． 微孔滤膜：0.45 μm，水系；0.22 μm，水系。 ，水系。 G． 旋涡振荡器 旋涡振荡器

H． KD浓缩瓶，25mL。 I． 固相萃取装置 固相萃取装置 J． 旋转蒸发仪 旋转蒸发仪 2． 试剂 试剂

16 

A． 乙腈：液相色谱纯。 乙腈：液相色谱纯。 B． 甲醇：液相色谱纯。 甲醇：液相色谱纯。 C． 二氯甲烷。 二氯甲烷。 D． 无水乙酸铵。 无水乙酸铵。 E． 5 mol/L5 mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取38.5 g38.5 g无水乙酸铵溶解于90 mL90 mL水中，冰乙酸调pH到7.0, 用水定容至100 mL。

F． 0.1 mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取7.71 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5。

G． 5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5，过0.2 滤膜。 mm滤膜。 H． 冰乙酸。 冰乙酸。

I． 0.25 g/mL盐酸羟铵溶液。 盐酸羟铵溶液。 J． 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸溶液: 称取17.2 g对-甲苯磺酸，用水溶解并定容至100 mL。

K． 2%（v/v）甲酸溶液。 ）甲酸溶液。

L． 5%（v/v）乙酸铵甲醇溶液：量取5 mL 乙酸铵缓冲溶液，用甲醇定容至100 mL。

M．阳离子交换柱：MCX，60 mg/3 mL，使用前依次用3 mL乙腈、3 mL甲酸溶液活化。 液活化。

N．中性氧化铝柱：1 g/3 mL，使用前用5 mL乙腈活化。 乙腈活化。 O．标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）、同位素内标氘代孔雀石绿（D5-MG）、同位素内标氘代隐色孔雀石绿（D6 -LMG），纯度大于98%。

P．标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100 mg/mL的标准贮备液， 准贮备液，

Q．混合标准储备溶液（1 ：分别准确吸取1.00 mL孔雀石绿、结晶紫、隐mg/mL）色孔雀石绿和隐色结晶紫的标准储备溶液至100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，1 mL该溶液分别含1 mg的孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫。-18℃避光保存。 避光保存。

R．混合标准储备溶液（100 ng/mL）：用乙腈稀释混合标准储备溶液，配制成每毫

100 ng的混合标准储备升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为100 ng

溶液。-18℃避光保存。 ℃避光保存。

S．混合内标标准溶液：用乙腈稀释标准溶液，混合内标标准溶液：用乙腈稀释标准溶液，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘用乙腈稀释标准溶液，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各100 ng的内标混合溶液。-18℃避光保存。 ℃避光保存。

T．混合标准工作溶液：根据需要，临用时吸取一定量的混合标准储备溶液和混合内标标准溶液，用乙腈－5 mmol/L乙酸铵溶液（1+1）稀释配制适当浓度的混合标准工作液，每毫升该混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各2 ng。

17 

3.  测定食品 测定食品 鱼、虾、鱼罐头等。 鱼、虾、鱼罐头等。 七、实验步骤 1． 样品处理 样品处理 ① 鲜活水产品： 鲜活水产品： 提取：称取5.00 g已捣碎样品于50 mL离心管中，加入11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8000 r/min 匀浆提取30 s，4000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中；另取一50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前30 s，超声波振荡5 一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，漩涡混匀器上振荡30 smin，4 000 r/min离心，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，离心5 min摇匀，样液经0.2 串联质谱测定。 mm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。 ② 加工水产品： 加工水产品： μL混合内标标准溶提取：称取5.00 g已捣碎样品于100 mL离心管中，加入200 1 mL盐酸羟胺、2 mL 2 mL 对-甲苯磺酸、2 mL2 mL乙酸铵缓冲溶液和40 mL40 mL液，依次加入1 mL乙腈，匀浆2 min (10000 r/min)，离心3 min (3000 r/min)，将上清液转移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振摇2 min，静置分层，收集下层有机层于150 mL梨形瓶中，再用20 mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，45℃旋转蒸发近干，用水定容至10.0 mL，样液经0.2 串联质谱测定。 mm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。 2．液相色谱－串联质谱条件： ．液相色谱－串联质谱条件： m；或性能相当者； ① 色谱柱：C18柱，50 mm×2.1 mm（i.d.），粒度3 µ；或性能相当者； ② 流动相：乙腈 乙酸铵 ； 流动相：乙腈 + 5 mmol/L乙酸铵 = 75+25 (v/v)③ 流速：0.2 mL/min；柱温：35℃；离子源：电喷雾离子源：电喷雾ESI，正离子；扫描方式：正离子；扫描方式：多反应监测MRM； ④ 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313（定量离子）、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316（定量离子）、331/239; 结晶紫m/z 372/356（定量离子）、372/251；隐色结晶紫m/z 374/359（定量离子）、374/238。 L。 ⑤ 进样量：10 µ按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液，以色谱峰面积定量。在上述色谱条件下孔雀石绿、氘代孔雀石绿、结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐2.30 min2.88 min5.21 色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为2.27 min、、、min、5.31 min、5.61 min，标准溶液的离子流图参见附录。 ，标准溶液的离子流图参见附录。 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 3． 测定结果的计算 测定结果的计算 试样中待测物的含量按下式计算获得： 试样中待测物的含量按下式计算获得： X=A1´c´V A2´m 18 式中： ； 式中： X------试样中待测组分的含量，单位为克每千克（g/kg）

A1-----试样中待测组分的峰面积； 试样中待测组分的峰面积； A2-----标准使用液中该组分的峰面积；

c------标准使用液中该组分的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

V------样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m------试样的质量，单位为克（g）。

八、思考题

1． 本实验中影响最后测定结果的因素有哪些？ 本实验中影响最后测定结果的因素有哪些？

九、实验报告

1． 预习报告 预习报告 2． 实验记录 实验记录 3． 实验报告 实验报告

独立完成实验报告并按时提交正式实验报告，用学校统一要求实验报告纸书写。

十、注意事项及其它说明

1． 注意事项参见实验一。 注意事项参见实验一。

19