维普资讯 http://www.cqvip.com 第３４卷第４期 ２００６年７月 东北林业大学学报 Ｖｏ１．３４ Ｎｏ．４ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＯＲＴＨＥＡＳＴ ＦＯＲＥＳＴＲＹ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｊｕ１．２０ｏ６ 外源激素对欧洲白桦器官再生与继代培养的影响 王进茂杨敏生甄志先曹 颖 Ｇ．Ｎａｕｊｏｋｓ （河北农业大学，保定，０７１０００） （Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄｕｃ￣，Ｗａｌｄｓｉｅｖｅｒｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ） 摘要欧洲白桦无性系２／８６叶柄更容易诱导愈伤组织和不定芽的分化。６一ＢＡ的诱导效果好于ＺＴ和 ＴＤＺ，较适宜的培养基为ＭＳ＋６一ＢＡ１．０＋ＫＴ０．３＋ＮＡＡ０．Ｏ１。６一ＢＡ质量浓度高与低均影响不定芽的诱导率。欧 洲白桦不定芽和嫩茎的增殖过程可分为增殖分化阶段与壮苗阶段，通过控制培养基中细胞紊的质量浓度来完 成对欧洲白桦试管苗生长状况的。 关键词欧洲白桦；器官发生；外源激素；继代培养 分类号￥７２２．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓ￣ａｎｄ Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ／Ｗａｎｇ Ｊｉｎｍａｏ，Ｙａｎｇ Ｍｉｎｓｈ— ｅｎｇ，Ｚｈｅｎ Ｚｈｉｘｉａｎ，Ｃａｏ Ｙｉｎｇ（Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ，ｙｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７ １０００，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）；Ｇ．Ｎａｕｊｏｋｓ（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ｄｄｓｉｅｖｅｒｓｄｏｒｆ．Ｇｅｒｍａｎｙ、／／ｌｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ． 一２０ｏ６．３４（４）．一１５一ｌ７ Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅ ２／８６（Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ Ｒｏｔｈ Ｘ Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ ｖａｒ．ｃａｒｅｌｉｃａ Ｓｏｋ）ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｃａｌｌｕｓ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｂｕｄｓ ｕｓｉｎｇ ｌｅａｆｓｔａｌｋｓ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ６．ＢＡ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆＺＴ ｎａｄ ＴＤＺ．Ｔｈｅ ｅｂｔｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｒｎ ｉｓ ＭＳ ｍａｅｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １．０ＩＩＩ Ｌ ６－ＢＡ＋Ｏ．３Ⅱ罾／Ｌ ＫＴ＋０．０１ ｍｇ／ＬＮＡＡ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｉｔｏｎ ｏｆ６．ＢＡｉｓ １．０ｍｇ／Ｌ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ６一ＢＡｍｏｒｅｔｈａｎ ｏｒｌｅＳＳｔｈａｎ １．０ｍｇ／／Ｌ Ｃａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｌｌｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ．Ｔｈｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｉｒｃｈ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐｓ ｉｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｓｔａｇｅｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｆａｓｔ—ｇｒｏｗｉｎｇ ｓｔａｇｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｃａｎ ｅｂ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈａｔ ｓｈｏｏｔｓ ｇｒｏｗ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ；Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅｓ；Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ 白桦属落叶乔木，是桦木科（Ｂｅｔｌｕａｃｅａｅ）桦木属（Ｂｅｔｕｌａ １．２．２增殖培养 Ｌｉｎｎａ）植物，该属约１００种，分布于我国的种类有３１种６变 将上面诱导不定芽发生过程中得到的不定芽分下面３种 种 Ｊ。白桦为草原向森林过渡的先锋树种，也是分布区内次 方式接人同一种增殖培养基中，３０ ｄ继代１次，连续继代培养 生林中主要阔叶先锋用材树种。芬兰、德国等国家先后对欧 ４次；每次转接时首先将高２ ｃｌｎ以上的嫩茎（有效嫩茎）剪下 洲白桦的组织培养、体细胞胚诱导及原生质体培养进行了研 来用于生根或增殖培养，同时统计有效嫩茎株数及茎的直径。 究 。詹亚光、杨传平、祖元刚分别从培养基和外植体的选 接入方式有３种。 择、内源激素的变化等多个方面对白桦（Ｂｅｔｕｌａ ｐ ①将高１ ｃｍ左右的茎尖接到分化培养基上，插入培养基 Ｓｕｋｓ）的再生体系进行了系统的研究，并初步对白桦进行了抗 中的部分为茎段，腋芽不能接触培养基。 虫基因转化的尝试 －９］。自２０世纪８Ｏ年代起，国际市场对 ②腋芽刚好埋于在培养基中，其他同处理①。 桦树木材的需求一直持续上升“ 。我国２００２年从德国引种 ③有３—５个芽着生在－－４＇块愈伤组织上的芽丛直接接 欧洲白桦无性系２／８６，该无性系为德国林木遗传育种研究所 人增殖培养基中。 从欧洲白桦（Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ ｖａｔ．ｃａｒｅｌｉｃａ Ｓｏｋ）和直干速生欧洲 １．２．３壮苗培养 白桦（Ｂｅｔｕｌａ ｐｅｎｄｕｌａ ＲｏｔＩ１）的杂交子代的ｌ０—２０年生的试验 将已充分分化的丛状嫩茎轮换接种到细胞素依次降 林中选出的，具有速生直干和优美曲纹纹理材质的特点 。 低的培养基中，最后调查试管苗质量。 笔者研究了外源激素对欧洲白桦优良无性系再生与继代培养 １．２．４培养基及培养条件 的影响，为满足我国白桦良种的定向培育及基因工程育种等 试验用培养基如表１所示，培养基中均含有２％蔗糖， 提供理论依据。 ０．６％琼脂，灭菌前ｐＨ调至５．８。组培室培养条件：温度（２５± １材料与方法 ３）℃，光照１ ５００—２ ０００ ｌｘ，光照时间１５ ｈ／ｄ。 １．１材料 ２结果与分析 欧洲白桦无性系２／８６组培苗。 ２．１ ６一ＢＡ质量浓度对不定芽再生的影响 １．２试验方法 选用ＷＰＭ为基本培养基，添加不同质量浓度的６一ＢＡ， １．２．１外植体选择及处理 并配合其他激素一起使用，研究６一ＢＡ对诱导欧洲白桦无性 分别取无性系２／８６试管苗的叶片为外植体。选取大小 系２／８５中龄叶片不定芽再生的影响，结果见表２。叶片在３ 尽量一致的叶片（带叶柄），用剪刀在叶片上剪３—４道伤口， 种培养基上，首先叶柄出现愈伤组织，在１１ ｄ左右叶脉伤口 且深达主脉。将处理好的外植体分别接人不同处理的培养基 处开始形成可见的愈伤组织。随时间推移，叶柄或叶脉处的 中。 愈伤组织在３种培养基上的发育状态和发育速度出现较大差 异。随着６～ＢＡ质量浓度的增加形成的愈伤组织块越多，生 １）中德合作项目（欧洲白桦、刺槐等用材阔叶树种引种、微繁及 长也较快。但培养２２ ｄ后，含６一ＢＡ０．５ ｍｇ／Ｌ的培养基上的 气候适应性研究２００２－－２００５）。 叶片开始黄化，愈伤组织也出现褐化现象；６一ＢＡ１．５ ｍｇ／Ｌ的 第一作者简介：王进茂，男１９６９年８月生，河北农业大学林学院， 情况类似。不定芽是由愈伤组织再生分化而来，３种培养基 副教授。 通讯作者：杨敏生。 上愈伤组织均可诱导不定芽发生，但分化率并未随６一ＢＡ质 收稿日期：２００５年１月２８日。 量浓度增大而相应增加。当６一ＢＡ质量浓度在１．５ｍｇ／Ｌ时， 责任编辑：戴芳天。 分化率反而下降；而６一ＢＡ在１．０ ｍｇ／Ｌ时分化率最高，不定 维普资讯 http://www.cqvip.com １６ 东北林业大学学报 第３４卷 芽长成有茎小苗的个数也多。这说明６一ＢＡ在１．０ ｍｇ／＇Ｌ时 培养 基号 Ａ１ Ａ２ Ａ３ Ｅ１ Ｅ２ Ｅ３ 效果较好，比较适合叶片不定芽的诱导。 基本培 养基 ＷＰＭ ＷＰＭ ＷＰＷ ＷＰＭ ＷＰＷ 表１试验用培养基 基本培 养基 ＷＰＭ ＷＰＷ ＷＰＭ ＷＰＭ ＷＰＷ ＷＰＭ 外源激素质量浓度／ｍｇ・Ｌ ６一ＢＡ ＫＴ ＮＡＡ ０．５ １．０ １．５ ０．７ ０．３ ０．１ ０．３ ０．３ ０．３ ０．３ ０．３ 一 ０．０１０ Ｏ．０１０ Ｏ．０１０ Ｏ．０ｏ１ ０．０ｏ１ Ｏ．０１０ 培养 基号 Ａ４ Ａ５ Ａ６ Ａ７ Ｅ４ 外源激素质量浓度／ｍｇ・Ｌ Ｉ１ ６一ＢＡ ＺＴ ＴＤＺ ＮＡＡ １．０ 一 一 一 一 一 １．０ 一 一 一 一 — ０．１ ０．１ 一 ０．０ｏ１ ０．０ｏ１ ０．０ｏ１ —０．１０ｏ ＩＡＡ 一 一 一 ０．００１ 一 表２ ６一ＢＡ对叶片不定芽再生的影响 注：＋不定芽诱导率指有不定芽分化的愈伤组织占愈伤组织总数的百分数（下同）。 ２．２细胞素种类对诱导不定芽再生的影响 以叶片为外植体，接人含有不同种类细胞素的培养 基中进行培养，３０ ｄ后愈伤组织和不定芽的分化情况见表３。 由表３可以看出，６一ＢＡ诱导白桦愈伤组织、不定芽分化的效 果好于ＺＴ、ＴＤＺ，并且特别显著。欧洲白桦对ｚＴ的反应非常 不敏感，１ ｍｇ／Ｌ的质量浓度几乎不能诱导白桦叶片细胞脱分 化或再分化。一般认为ＴＤＺ的生理活性高于６一ＢＡ，因此试 验中采用０．１ ｍｇ／Ｌ的ＴＤＺ代替１ ｍｇ／Ｌ的６一ＢＡ配合０．００１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ诱导白桦叶片不定芽分化，结果表明ＴＤＺ的确表 现出较强的生理活性，使欧洲白桦叶片强烈脱分化形成大量 的愈伤组织，却抑制了不定芽的分化。可是如果用同等质量 浓度的Ｉ从替换ＮＡＡ与ＴＤＺ共同作用，则能减弱愈伤组织 的诱导，并诱导不定芽的发生；但与６一ＢＡ相比，不定芽诱导 形成的时间拖后，而且不定芽不易正常抽茎发育成有效嫩茎， 愈伤组织在培养后期也容易老化，应及时更换新鲜培养基。 这也说明ＴＤＺ在诱导欧洲白桦无性系２／８６的叶片不定芽发 生时，它的合理使用质量浓度，以及与之配合使用的生长素种 类与质量浓度还有待进一步研究确定。 表３激素种类对不定芽分化的影响 ２．３不定芽的增殖培养 ２．３．１ 继代方式对不定芽增殖的影响 来的５０％，仅有０．３６ ｍｉｌｌ。转接方式②与①主要不同点在前 两阶段，在原茎尖基部切口愈伤的同时，茎尖基部腋芽迅速萌 发分化生长，一般在第一阶段能得到几个有效嫩茎。后面的 发育历程基本相同。转接方式③，初期新生嫩茎不断地从愈 伤组织和原有嫩茎基部叶腋处分化萌发生长，因而这种方式 有着最高的繁殖系数，继代第４次时新生有效嫩茎数为转接 方式②与①的将近２倍。但继代培养４次后，其嫩茎也最弱 的（如图１、２所示），这样的嫩茎如用于生根，将直接影响生 根试管苗的移栽成活率。 将上述在叶片外植体上诱导得到的不定芽进行增殖培 养，及用腋芽再生方式进行欧洲白桦组培苗生产过程中，我们 发现不同的继代方式对白桦组培苗的增殖系数以及试管苗的 生长状况影响很大。固设计３种接苗方式：①将高１ ｃｍ左右 的茎尖接到分化培养基Ｅ１上，插入培养基中的部分为茎段， 腋芽不能接触培养基；②腋芽刚好埋于在培养基中，其他同处 理①；③有３—５个芽着生在－－Ａ，块愈伤组织上的芽丛直接接 人增殖培养基中。以确定合理的不定芽增殖方式。试验表 明，不同的接人方式直接影响白桦试管苗增殖系数的大小和 试管苗的生长状况（如图１、２所示）。 转接方式①，其试管苗的增殖可分为３个阶段。第一阶 段即茎尖下端首先愈伤化，然后再从愈伤组织分化出不定芽； 这与茎段外植体再生不定芽的过程极为相似，同时原接人茎 尖高生长减慢、茎增粗、叶片增大，这一阶段大约需要３０ ｄ。 第二阶段，前一阶段分化出的不定芽抽茎形成芽丛，部分长成 有效嫩茎。第三阶段，上阶段形成的芽丛强烈分化，分化方式 主要是腋芽持续萌生，这时期主要特点是：茎的高生长也较 快，但由于大量营养被用于分化，新生嫩茎较细，叶片也很小， 而且这种现象随继代次数的增加加重，嫩茎最细可减少到原 萋 差 艟 继代次数／次 图１ 继代次数过程中产生效嫩茎个数的变化 维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 王进茂等：外源激素对欧洲白桦器官再生与继代培养的影响 目１７ 枣矧堋鹫袈 ｜ 通 堋 餐 ・ 图２继代过程有效嫩茎直径在继代过程中的变化 ２．３．２壮苗培养 为了获得足够健壮的有效嫩茎，要将已充分分化的丛状 嫩茎接种到细胞素较低的培养基中，促使嫩茎长高、茎加 粗、叶片增大。在分化培养基Ｅ１的基础上，增加Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４ 三种培养基，芽丛继代培养时沿６一ＢＡ质量浓度依次降低次 序，每３０ ｄ换１次培养基，轮换使用。图３、４是依次在上述４ 种培养基培养时有效嫩茎个数和直径的变化情况。从图３、４ 可以看出，第一次细胞素质量浓度降低时嫩茎个数与嫩 茎直径均变化不明显；再次降低时，有效嫩茎个数大幅减少， 有效嫩茎直径也得以提高；当完全去掉细胞素后有效嫩 茎继续减少，而有效嫩茎的生长状况大为改善，茎曾粗明显， 叶片变大。经试验这在大批量生产白桦试管苗过程中是一个 非常有效的办法，也说明白桦不定芽和嫩茎在增殖过程中具 有阶段性，即增殖分化阶段与壮苗阶段。 ＜－ 霸 ＜－ ｛ｌｏ｛ 釜 ：｝｝ｋ 澍 培养基 图３不同培养基中有效嫩茎个数的变化 培养基 图４不同培养基中有效嫩茎直径的变化 ３结论与讨论 细胞素和生长素对芽的诱导和生长发育均起着重要 的作用，一般诱导不定芽的形成时细胞素高于生长素的 用量或只用细胞素；而诱导不定根发生只用生长素或配 合使用较低质量浓度的细胞素” 。欧洲白桦无性系２／ ８６的叶片在含６一ＢＡ０．５～１．５ ｍｇ／Ｌ的培养基上均能诱导不 定芽分化，较适宜的培养基为ＭＳ＋６一ＢＡ１．０＋ＫＴＯ．３＋ ＮＡＡ０．Ｏ１。６一ＢＡ适宜质量浓度为１．０ｍｇ／Ｌ，高与低均影响 不定芽的诱导率。这与陶静、詹亚光等在研究白桦茎节诱导 不定芽分化时的结果是一致的” 。对诱导不定芽发生ＴＤＺ 在某些树种表现出特别的效果。０．００２～０．０５０ ｍｇ／Ｌ的ＴＤＺ 可诱导椴树、花楸、洋槐、黑核桃等植物形成大量的芽，同比效 果是ＢＡ的５０～１００倍 。对欧洲白桦来说，６一ＢＡ的诱导 效果好于ＺＴ和ＴＤＺ，ＺＴ几乎不能诱导欧洲白桦叶片愈伤组 织和不定芽的发生。ＴＤＺ表现出较强的生理活性，使欧洲白 桦叶片强烈脱分化形成大量的愈伤组织，反而抑制了不定芽 的分化。达克东ｕ 、谷瑞升 等也曾观察到过量的愈伤组 织抑制苹果叶片和胡杨茎段的植株再生。可是如果用同等质 量浓度的ＩＡＡ替换ＮＡＡ与ＴＤＺ共同作用，则能减弱愈伤组 织的诱导，并诱导不定芽的发生，因此ＴＤＺ诱导欧洲白桦不 定芽再生的合理质量浓度有待进一步研究确定。 植物组织培养在实际生产上的最终应用，与目的植株具 有较高的繁殖系数是分不开的。詹亚光、陶静 Ｊ 等试验与 本研究均表明，白桦不定芽和嫩茎的增殖有较高的繁殖系数； 整个增殖过程可分为增殖分化阶段与壮苗生根阶段，即用丛 生芽的方式进行继代培养，以获得最高的繁殖系数，通过控制 培养基中细胞素的质量浓度来完成对白桦试管苗生长状 况的。 自桦不定芽与嫩茎的增殖主要通过两种方式，即通过愈 伤组织再生不定芽的间接方式和腋芽抽茎的直接方式【】 。 愈伤组织或试管苗继代时间的长短与遗传稳定性有关。随赤 桉再生植株继代次数的增加，其根尖染色体的正常频率在继 代２—３ ａ后甚至可降到６０％Ｌ】 。因此进行白桦大批量离体 繁殖时，应选择合理的增殖方式，减少或避免由愈伤再生不定 芽的比例，加大由腋芽再生的比重，并积极开展白桦试管苗繁 殖过程中的遗传变异的研究，确定适当的继代次数。 参考文献 ［１］关文彬．综合述评中国东北地区白桦林植被生态学的研究—— 桦属植物与中国白桦林的地理分布［Ｊ］．北京林业大学学报， １９９８，２０（４）：１０４—１０９． ［２］ 陶静，闫淑兰，刘丹，等．国内外桦树育种和遗传转化研究的现 状及前景展望［Ｊ］．吉林林业科技。１９９８（３）：３３—３７． ［３］ＥｗＭｄ Ｄ。Ｎａｕｊｏｋｓ Ｇ Ｈ．Ｐｉｅｇｅｒｔ Ｐｅｆｒｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ Ｗｏｏｄ ＵＱａｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｕｄｙ Ｂｉｒｃｈ（Ｂｅｔｕ／ａ ｐｅｎｄｕ／ａ×Ｂｅｎｔｕ／ａ ｐｅｎｄｕ／ａ ｖａｌ＂．ｃａｒｄ／ｃａ Ｓｏｋ．）Ｃｌｏｎｅｓ［Ｊ］．Ｓｉｌｖａｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，４９ （２）：９８～１０１． ［４］ 陶静，杨传平，刘玉喜，等．白桦组培再生系统的研究（Ⅱ）——影响 因素及培养程序［Ｊ］．东北林业大学学报，ｌ９９８，２６（６）：ｌ一５． ［５］祖元刚，孔瑾，吴双秀，等．白桦下胚轴再生系统的建立［Ｊ］．植 物研究，２００１，２１（４）：６１５—６１９． 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