黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107441061 A(43)申请公布日 2017.12.08

(21)申请号 201710903326.9(22)申请日 2017.09.29

(71)申请人 长春金赛药业股份有限公司

地址 130012 吉林省长春市高新区越达路

1718号(72)发明人 金磊　唐星　张士权　徐万国　

刘志红　(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人 张柳　赵青朵(51)Int.Cl.

A61K 9/52(2006.01)A61K 9/51(2006.01)A61K 31/57(2006.01)A61K 47/34(2017.01)

权利要求书1页 说明书15页 附图5页

A61P 15/06(2006.01)

(54)发明名称

黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂(57)摘要

本发明提供了一种经过PEG修饰的黄体酮纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂，本发明提供的制剂包括黄体酮及生物可降解聚合物PLGA、PLA、PCL、PGA等；工艺方面分别采用纳米乳法制备黄体酮纳米粒。本发明所制备的纳米粒径在100-400nm范围内，载药量可达到1％-10％，包封率在80％-100％。黄体酮上市制剂需多次频繁给药，而本发明提供的黄体酮缓释注射剂比市售制剂和传统黄体酮纳米粒有更高的生物利用度，并且达到了一周以上的缓释效果，可以增加患者用药的依从性，提高生活质量。CN 107441061 ACN 107441061 A

权　利　要　求　书

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1.一种黄体酮纳米粒，其特征在于，其包括黄体酮和聚合物，所述黄体酮纳米粒经PEG修饰。

2.根据权利要求1所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述聚合物包括PEG聚合物，所述PEG聚合物选自聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乙二醇-聚己内酯。

3.根据权利要求1或2所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述聚合物还包括骨架聚合物；所述骨架聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯或聚乙醇酸中。

4.根据权利要求1至3任一项所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述黄体酮缓释纳米粒的粒径为100-400nm。

5.根据权利要求2至4任一项所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述骨架聚合物的分子量为4000～40000道尔顿；所述PEG聚合物的分子量为1000-10000道尔顿。

6.根据权利要求5所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000-40000道尔顿；所述聚乳酸的分子量为10000-20000道尔顿；所述聚己内酯的分子量为4000-40000道尔顿；所述聚乙醇酸的分子量为8000-20000道尔顿。

7.根据权利要求2至6任一项所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(50～85):(15～50)。

8.根据权利要求3至7任一项所述的黄体酮纳米粒，其特征在于，所述骨架聚合物或所述PEG聚合物占黄体酮纳米粒的质量百分含量为5％～85％。

9.一种如权利要求1至8任一项所述的黄体酮缓释纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将黄体酮与聚合物溶于有机溶剂中，形成有机相；2)将步骤1)得到的有机相与含乳化剂的水溶液中，经剪切乳化，得到水包油型初乳液；将所述水包油型初乳液匀质，得到终乳液；

3)将步骤2)得到的终乳液固化，得到微粒混悬液；4)将步骤3)得到的微粒混悬液洗涤，浓缩得到浓缩液，与保护剂混合后冻干或者喷雾干燥得到黄体酮缓释纳米粒。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述乳化剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆477或聚乙烯醇；所述乳化剂的浓度为0.3％～5％；

所述保护剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、PEG-4000、PEG-6000、PEG-10000、氯化钠或羟丙基β-环糊精。

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黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂

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技术领域

[0001]本发明涉及制药技术领域，特别涉及黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂。

背景技术[0002]习惯性流产指的是连续发生≥3次的自然流产，其发病诱因尚不完全明确，给病人心理带来巨大的伤害。复发性流产发病诱因繁多，并较为复杂，其主要有免疫因素、遗传以及内分泌紊乱等，因此给临床治疗带来一定的难度。根据相关实践研究表明，患有这种疾病的病人身体当中的黄体功能不全的为24％-68％。对于黄体缺陷的发生，研究者多认为是由于绝大多数试管婴儿周期中使用促性腺激素释放激素激动剂(Gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa)进行降调节，GnRha引起垂体抑制，使得垂体功能恢复相对推迟，导致妊娠早期黄体功能缺陷。临床应用试管婴儿等人工助孕技术30多年以来，黄体期药物支持治疗逐渐被公认为是有利于妊娠结局的一种干预手段。[0003]黄体酮(Progesterone)，又名孕酮，为白色或微黄色结晶粉末，熔点127～131℃，无臭，在空气中稳定，有右旋光性，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、二氧六环和浓硫酸。黄体酮的化学名称为：孕甾-4-烯-3,20-二酮，分子式：C21H30O2，分子量：314.47，结构式如式Ⅰ所示：

[0004]

黄体酮能够使增值期内膜转化成为分泌期内膜，为受精卵植入、着床以及初期胚胎的营养支持提供便利条件。孕酮可以使细胞当中钠离子浓度明显升高，使肌纤维兴奋性明显下降，以及使肌纤维明显松弛，进而使宫缩明显减少，最终使胚胎在子宫当中继续进行生长发育；黄体激素对妊娠的积极作用主要体现在诱导子宫内膜向分泌期转变，增加内膜容受性以利于受精卵着床，以及作用于子宫局部，经一氧化氮等因子促使血管及平滑肌舒张而抑制宫缩。

[0006]临床上黄体酮应用剂型主要有口服胶囊、凝胶栓剂、肌注油溶制剂等，其中，黄体酮口服制剂给药方便快捷，患者易于接受，但是口服黄体酮会在胃肠道及肝脏迅速破坏，难以起到补充和治疗作用。由于黄体酮溶解度极低，且首过效应严重，口服生物利用度仅为10％。口服制剂往往通过增加表面活性剂浓度来提高黄体酮溶解度，不能从根本上解决黄体酮首过效应强、生物利用度低的问题；每天的给药剂量仍需很大才能达到疗效，导致副作

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[0005]

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用较大。因此，临床上普遍使用油溶液肌注，价格也相对低廉。[0007]但是，现有的黄体酮注射剂为油溶液注射剂，需每天注射，长期注射(约12周)。油溶液注射时极易引起患者不适，如疼痛、局部红肿、过敏等症状，个别病理报道甚至指出肌肉注射黄体酮可诱发急性嗜酸性粒细胞肺炎。且油剂黄体酮半衰期长，通常要数周时间才能恢复。长期高频次注射也会导致注射部位产生硬结等其他症状，不利于注射部位组织健康。患者均为孕妇，每天注射黄体酮极为不便，且黄体酮注射存在油溶剂易引起肌肉板结、疼痛等问题。

[0008]在传统的缓释制剂中，微球一直是一种最常用的剂型，因为传统的纳米粒由于粒径较小，在肌肉注射之后很容易吸引吞噬细胞，从而将其吞噬，虽然相比微球纳米粒的生物利用度更高，但是因为这个原因导致纳米粒很难达到长效的作用。发明内容

[0009]有鉴于此，本申请提供一种经PEG修饰的黄体酮缓释纳米粒及其制备方法和黄体酮缓释注射剂，本发明提供的经PEG修饰的黄体酮缓释纳米粒可用作肌肉注射剂，载药量高，体内外持续释放时间长，且注射刺激性小，患者顺应性好。[0010]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0011]本发明提供了一种黄体酮纳米粒，其包括黄体酮和聚合物，所述黄体酮纳米粒经PEG修饰。

[0012]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合物包括PEG聚合物，所述PEG聚合物选自聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)或聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)。[0013]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚合物还包括骨架聚合物；所述骨架聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)或聚乙醇酸中(PGA)。[0014]在本发明的一些具体实施方案中，所述黄体酮缓释纳米粒的粒径为100-400nm。[0015]在本发明的一些具体实施方案中，所述骨架聚合物的分子量为4000～40000道尔顿；所述PEG聚合物的分子量为1000-10000道尔顿。[0016]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000-40000道尔顿；所述聚乳酸的分子量为10000-20000道尔顿；所述聚己内酯的分子量为4000-40000道尔顿；所述聚乙醇酸的分子量为8000-20000道尔顿。[0017]在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(50～85):(15～50)。

[0018]在本发明的一些具体实施方案中，所述骨架聚合物与所述PEG聚合物的比例为5％～85％。

[0019]本发明还提供了一种黄体酮缓释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：[0020]1)将黄体酮与聚合物溶于有机溶剂中，形成有机相；[0021]2)将步骤1)得到的有机相与含乳化剂的水溶液中，经高速剪切乳化，得到水包油型初乳液；将所述水包油型初乳液高压匀质，得到终乳液；[0022]3)将步骤2)得到的终乳液低温固化，得到微粒混悬液；[0023]4)将步骤3)得到的微粒混悬液洗涤，浓缩得到浓缩液，与保护剂混合后冻干或者喷雾干燥得到黄体酮缓释纳米粒。

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CN 107441061 A[0024]

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作为优选，步骤4)中所述洗涤为用中空纤维膜组件(截留分子量为5000)循环加水

5-10次洗涤。

[0025]在本发明的一些具体实施方案中，所述乳化剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆477或聚乙烯醇；所述乳化剂的浓度为0.3％～5％；所述保护剂选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、PEG-4000、PEG-6000、PEG-10000、氯化钠或羟丙基β-环糊精。[0026]本发明还提供了含有上述黄体酮缓释纳米粒的制剂，剂型优选为注射剂。[0027]本发明提供的黄体酮缓释纳米粒的外形圆整，粒度分布均匀，载药量和包封率高，体内外持续释放一周以上，累计释放90％以上，且释放均一稳定，可较长时间维持有效血药浓度，给药一次可维持一周治疗之久，注射刺激性小，患者顺应性好。附图说明

[0028]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0029]图1示肌肉注射经PEG修饰的黄体酮纳米粒与不同剂量的市售油溶液药时曲线图；[0030]图2示肌肉注射经PEG修饰的黄体酮纳米粒与传统黄体酮纳米粒的药时曲线图；[0031]图3示肌肉注射经PEG修饰的黄体酮纳米粒一半剂量与油溶液药时曲线图；经过PEG修饰的纳米粒即使在给药量是市售(14.58mg/kg)的一半时候血药浓度仍然与现存的每日肌肉注射黄体酮的血药浓度相当；可见PEG修饰的纳米粒可以降低给药剂量；[0032]图4示两种纳米粒的体外释放曲线图；

[0033]图5示经PEG修饰的黄体酮纳米粒的透射电镜图；[0034]图6示传统黄体酮纳米粒的透射电镜图(TEM)；

[0035]图7示肌肉注射不同黄体酮处方制剂的药时曲线图。

具体实施方式

[0036]本发明公开了黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0037]本发明提供一种黄体酮缓释纳米粒，其包括黄体酮和聚合物制成。所述聚合物包括骨架聚合物和PEG聚合物；所述骨架聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸；所述骨架聚合物的分子量为6000～60000道尔顿；所述PEG聚合物为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)，聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)一种或者两种。[0038]所述黄体酮占所述聚合物总质量的10％～50％；[0039]所述黄体酮缓释纳米粒的粒径为100～400nm。[0040]为解决黄体酮临床应用剂型上的不足，本发明人经大量研究发明了可用于肌肉注射的黄体酮缓释纳米粒，药物包埋于生物可降解、组织相容性良好的聚合物内，体内可持续缓释一周以上，安全性较强，刺激性小，提高患者顺应性。[0041]为实现上述目的，本发明提供了如下多种实施方案。

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CN 107441061 A[0042]

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在本发明中，所述骨架聚合物的分子量为6000～60000道尔顿；具体地，所述聚乳

酸-羟基乙酸共聚物的分子量可为10000-60000道尔顿；聚乳酸的分子量可为20000-30000道尔顿；聚己内酯的分子量可为6000-50000道尔顿；聚乙醇酸的分子量可为10000-30000道尔顿。在本发明的一些实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000-40000道尔顿。

[0043]在本发明中，所述骨架聚合物材料的封端方式可为羧基封端、酯封端和羟基封端中的一种或多种；具体地，所述PLGA为羧基封端、酯封端或羟基封端；所述PCL为羧基封端、酯封端或羟基封端；所述PLA为羧基封端、酯封端或羟基封端。[0044]在本发明的优选实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(50～85)：(15～50)。所述PLGA的乳酸和羟基乙酸的摩尔比优选为50：50、75：25或85：15；分子量为10000-40000道尔顿，一周持续释放药物90％以上。

[0045]所述PEG聚合物材料选自聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸或者聚乙二醇-聚己内酯的一种或两种；所述PEG聚合物材料的聚乙二醇的分子量在1000道尔顿-10000道尔顿。在上述实施方案中，所述纳米粒载药量为3％-10％。[0046]在上述实施方案中，所述纳米粒粒径控制在100nm-400nm。[0047]本发明还提供一种黄体酮缓释纳米粒的制备方法，包括以下步骤：[0048]1)将黄体酮和聚合物溶于有机溶剂中，形成有机相；

[0049]2)将步骤1)得到的有机相倒入含乳化剂的水溶液中，经高速(6000rpm～10000rpm)剪切乳化，得到水包油型初乳液；将所述水包油型初乳液进行高压(600bar～800bar)匀质，得到终乳液；

[0050]3)将步骤2)得到的终乳液用水稀释后，通过低温(0～5℃)固化，得到微粒混悬液；[0051]4)将步骤3)得到的微粒混悬液用切线流除去有机溶剂和游离药物后，得到黄体酮缓释纳米粒。

[0052]为实现上述目的，本发明另一些实施例提供的黄体酮纳米粒的制备的技术方案包括如下步骤：[0053](1)将黄体酮和聚合物材料溶于处方量的乙酸乙酯和苯甲醇中，形成有机相；(2)将步骤(1)中的有机相迅速倒入含有乳化剂和少量乙酸乙酯与苯甲醇的水溶液中经高速剪切乳化，得到o/w初乳，初乳经高压匀质机进一步降低粒径，得到终乳；(3)将步骤(2)所得终乳用冷水稀释，冰浴下搅拌3-4h固化微粒，得到微粒混悬液；(4)将步骤(3)所得微粒混悬液加入冷水，过空心膜组件(组件的截留分子量为5000)除去有机溶剂，干燥后得到黄体酮缓释纳米粒。

[0054]此外，本发明可将除去有机溶剂的物质分装在西林瓶中，加入适合的冻干保护剂进行冷冻干燥(冻干)，即得黄体酮缓释冻干粉针。[0055]本发明称取聚合物和黄体酮，加入有机溶剂中溶解，作为有机相。其中，所述聚合物的内容如前所述，在此不再一一赘述。此外，本发明对黄体酮的晶型没有特殊限制。在本发明中，黄体酮与聚合物投料重量比可为1：(2-10)。[0056]在上述本发明的纳米粒制备方法中，所述有机溶剂如醇类、烃类、酯类等。在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂为乙酸乙酯和苯甲醇的混合溶液；具体地，乙酸乙酯和苯甲醇的体积比可为4：1。本发明优选采用乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂，将聚合物材料和黄体

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CN 107441061 A

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酮于30～40℃水浴搅拌，溶解后得到有机相。[0057]在制备纳米粒的过程中，本发明实施例将得到的有机相迅速倒入含乳化剂的水溶液中，高速剪切形成o/w初乳液；将所述初乳液进行高压匀质，得到终乳液。其中，所用的乳化剂优选为泊洛沙姆188；还可采用苯甲醇作为助乳化剂。泊洛沙姆(Poloxamer)为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，商品名为普兰尼克(Pluronic)，属于高分子非离子表面活性剂。泊洛沙姆188也称F68，是一种水包油乳化剂。在本发明的一些实施例中，泊洛沙姆188在水相中的质量浓度为0.5％-2％；苯甲醇在水相中的质量浓度为1％-5％。此外，所述含乳化剂的水溶液中还可包含乙酸乙酯等，共同作为水相。具体地，所述油水相体积比可为1：8。[0058]在本发明的一些实施例中，所述高速剪切的转速可为10000rpm；剪切时间可为5min。在本发明的一些实施例中，所述高压匀质的压力可为600bar；匀质次数为5-7次。[0059]得到终乳后，本发明实施例用冷水稀释，通过冰浴下搅拌的低温固化方式，固化微粒得到微粒混悬液；再加入冷水过空心膜组件，除去有机溶剂，干燥即得黄体酮缓释纳米粒。

[0060]或者，将除去有机溶剂的物质加入冻干保护剂，经冻干，得到冻干粉针。所述的冻干保护剂可选自乳糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、丙三醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、磷酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、不同分子量的聚乙二醇和白蛋白中的一种或几种，优选为甘露醇。

[0061]本发明所述的注射用黄体酮缓释纳米粒的外形圆整，粒度分布均匀，载药量和包封率高，体内外持续释放一周以上，累计释放90％以上，且释放均一稳定，可较长时间维持有效血药浓度，给药一次可维持一周治疗之久，注射刺激性小，患者顺应性好。[0062]本发明的黄体酮长效制剂技术上采用纳米乳化法制备黄体酮纳米粒，在纳米级别实现药物的控释。采用生物可降解高分子材料包裹药物制成注射用纳米粒制剂给药后，药物通过在纳米粒内的扩散和聚合物骨架的溶蚀控制释放，达到长效平稳缓释的目的。[0063]实验表明本制剂在体内可维持有效血药浓度，达到一周及以上的缓释效果，因而可以提高患者的依从性，提高疗效。

[0064]本发明还提供一种黄体酮缓释注射剂，其包括黄体酮颗粒和注射用溶剂；所述黄体酮颗粒为上文所述黄体酮缓释纳米粒。

[0065]本发明提供的黄体酮缓释注射剂为纳米粒黄体酮长效制剂，该长效制剂包括黄体酮及生物可降解聚合物PLGA(乙交酯丙交酯共聚物)、PLA(聚乳酸)、PCL(聚己内酯)、PGA(聚乙醇酸)和mPEG-PLGA，mPEG-PCL等；工艺方面分别采用纳米乳法制备黄体酮纳米粒。[0066]根据研究人员进行的临床调查，目前临床上治疗习惯性流产和辅助生殖剂量为肌注20mg/day和60mg/day。而本发明制剂设计剂量为140mg/周，一周给药一次。在给药剂量和频率上均少于临床普通制剂，而本品在后续药动和药效学学研究结果显示，本品生物利用度和治疗效果与市售制剂相当；而给药剂量和频率的减少可降低副作用的发生率，提高患者依从性。

[0067]本发明提供的黄体酮缓释纳米粒、其制备方法和黄体酮缓释注射剂中所用原料及试剂均可由市场购得。[0068]下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0069]实施例1-3不同比例的聚合物(PLGA)制备黄体酮纳米粒

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CN 107441061 A[0070]

说　明　书

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以处方量称取PLGA(Mw＝20000)，mPEG-PLGA(PEG Mw＝5000；PLGA Mw＝2400)和黄

体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，在冰水浴中淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒；载药量分别为7.7％，7.1％，10％；包封率为91％，91.2％，93％。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。实施例1-3中的处方及相关工艺参见表1：[0071]表1实施例1-3中的处方及相关工艺参数

[0072]

实施例4-6不同比例的聚合物(PLA)制备黄体酮纳米粒

[0074]以处方量称取PLA(Mw＝20000)，mPEG-PLGA(PEG Mw＝5000；PLGA Mw＝2400)和黄体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，在冰水浴中淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒；载药量分别为4.5％，4.9％，4.2％；包封率为94％，99.5％，99.2％。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。实施例4-6中的处方及相关工艺参见表2：

[0075]表2：实施例4-6中的处方及相关工艺参数

[0073]

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CN 107441061 A[0076]

说　明　书

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实施例7-9不同比例的聚合物(PGA)制备黄体酮纳米粒

[0078]以处方量称取PGA(Mw＝20000)，mPEG-PLGA(PEG Mw＝5000；PLGA Mw＝2400)和黄体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，在冰水浴中淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒；载药量分别为1.2％，3.2％，3.7％；包封率为80％，82.2％，93％。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。实施例7-9中的处方及相关工艺参见表3：[0079]表3：实施例7-9中的处方及相关工艺参数

[0077]

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CN 107441061 A[0080]

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实施例10-12不同比例的聚合物(PCL)制备黄体酮纳米粒

[0082]以处方量称取PCL(Mw＝20000)，mPEG-PLGA(PEG Mw＝5000；PLGA Mw＝2400)和黄体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，在冰水浴中淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒；载药量分别为4.7％，4.0％，3.3％；包封率为92％，91.2％，93.1％。。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。实施例1-3中的处方及相关工艺参见表4：

[0083]表4：实施例10-12中的处方及相关工艺参数

[0081]

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对比例1传统黄体酮纳米粒的制备

[0086]以处方量称取PLGA(Mw＝20000)和黄体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，加冷水淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒，载药量为7％。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。对比例中的处方及相关工艺参见表5。[0087]表5对比例1中的处方及相关工艺参数

[0085]

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对比例2～4

[0090]以处方量称取PLGA(对比例2～4中，Mw分别为70000、5000、80000)，mPEG-PLGA(对比例2～4中，PEG Mw分别为900、950、11000；PLGA Mw＝800)和黄体酮，加入乙酸乙酯和苯甲醇混合溶剂中，于35℃水浴搅拌溶解后作为有机相。将F68作为乳化剂溶于水溶液，再加入处方量的苯甲醇以及乙酸乙酯于35℃加热搅拌均匀后作为水相。在剪切条件下将有机相加入到水相中，得到初乳后，经过高压均质后，加冷水淬火(温度控制在<5℃)，搅拌固化3-4h，加入冷水经过中空纤维膜组件除去有机溶剂，离心过滤后，得黄体酮纳米粒；载药量分别为5.7％，6.1％，6.3％。再加入合适的冻干保护剂冻干后，得黄体酮冻干粉针。[0091]表6对比例2～4中的处方及相关工艺参数

[0089]

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[0093][0094]

表7：对照组(2-4)的药动学参数

注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差

异(P＜0.01)；

[0096]结果分析：可以发现对照组的各个药动学参数与本发明的药动学参数都有极显著性的差异(P＜0.01)，本发明结果显著优于对照组。[0097]取本发明实施例1、实施例3～12进行上述试验，试验结果与实施例2的结果无显著差异(P＞0.05)。表明本发明提供的实施例的药动学参数均与对照组具有显著或极显著差异。

[0098]实施例13本发明的黄体酮长效制剂的药物动力学分析

[0099]根据实施例2的方法所制备的2.08mg(以黄体酮计)的黄体酮纳米粒，对SD大鼠(体重大约200g)的后腿股二头肌进行肌肉注射，并以市售油溶液和对比例1制得的普通黄体酮纳米粒作为对照试验。本发明缓释制剂中的注射用溶剂即注射用纳米粒复溶剂，成分为0.9％的氯化钠注射用水。

[0100]对受试大鼠定期眼后静脉丛取血，通过建立LC-MS法测定血浆中黄体酮的药物浓

[0095]

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度。给药0-196h的血药浓度参见图1，图1为本发明实施例2黄体酮纳米粒与不同剂量的市售油溶液的浓度曲线图。从图1药动力学试验结果可以看出，本发明提供的黄体酮纳米粒的生物利用度和治疗效果显著(P＜0.05)好于同等剂量的市售油溶液甚至能等同于三倍剂量的油溶液给药方案。

[0101]图2为本发明实施例2黄体酮纳米粒与传统黄体酮纳米粒的浓度曲线图。表8：单次肌肉注射经PEG修饰的纳米粒(14.58mg/kg)和连续给药7天黄体酮油溶液(2.08mg/kg)的相关药动学参数

[0102]

可以发现，本发明实施例2提供的经PEG修饰的黄体酮纳米粒的药时曲线下面积是

市售油溶液的4.7倍，药物半衰期也提高了627％，并且从图2可以发现纳米粒的曲线一直在市售油溶液的上方，所以本发明的纳米粒在一次注射可以保证7天和市售油溶液相同的疗效。

[0104]本发明在后续试验中降低了纳米粒的给药剂量，从表9可以发现即使降低一半的给药剂量，各个药动学参数都是纳米粒占据显著优势，而且从图3可以发现本发明的纳米粒在剂量降低一半仍然可以与市售油溶液相当。所以本发明的纳米粒可以降低给药剂量而达到与市售同样的疗效。从而降低了黄体酮有可能带来的副作用。[0105]表9：单次肌肉注射经PEG修饰的纳米粒(7.29mg/kg)和连续给药7天黄体酮油溶液(2.08mg/kg)的相关药动学参数

[0103][0106]

[0107]

表10：实施例1、3的药动学参数

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[0109][0110]

表11：实施例4-6的药动学参数

[0111][0112]

表12：实施例7-9的药动学参数

[0113][0114]

表13：实施例10-12的药动学参数

取本发明实施例1、3～12、对比例2～4进行上述实验，详见表10～13，实验结果与

实施例2制得的黄体酮纳米粒的实验数据无显著差异，表明本发明提供的黄体酮纳米粒生物利用度和治疗效果显著优于市售有溶液以及对比例1～4制得的纳米粒。[0116]实施例14黄体酮长效制剂特性测试[0117]外观检测。将上述对比例1和实施例2制备出的黄体酮纳米粒于透射电镜下观察，结果参见图5和图6。图5为本发明实施例制备的经PEG修饰的黄体酮纳米粒的透射电镜图像(TEM)，图6为本发明对比例1制备的传统黄体酮纳米粒的透射电镜图电镜图(TEM)。从以上结果可见，本发明实施例2和对比例1制备出的纳米粒呈规则圆形，且粒径相当。[0118]载药量：精密量取上述实施例制备出的纳米粒10mg置25mL容量瓶中，加入1mL乙腈振荡溶解，用乙腈定容置刻度，混匀，用0.45μm微孔滤膜过滤即可。用HPLC法测定载药量和

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[0115]

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包封率，计算公式如下，

[0119][0120]

包封率的测定：采用超滤法测定。将1ml黄体酮纳米粒与1ml甲醇加入至超滤管，在3000rpm下离心15min，之后用HPLC法测定接收到的液体中的黄体酮的含量。

[0121]

取本发明实施例1、3～12、对比例2～4进行上述实验，实验结果与实施例2制得的黄体酮纳米粒的实验数据无显著差异，表明本发明提供的黄体酮纳米粒呈规则圆形，且粒径相当；且载药量和包封率显著(P＜0.05)优于市售有溶液以及对比例1～4制得的纳米粒。[0122]实施例15释放行为

[0123]关于体外释放度方法的建立，本发明采用37度、300rpm/min流通池法测定体外释放。释放介质采用20％PEG400溶液以满足漏槽条件。在规定时间取样时，将6.5ml接收池的释放介质全部取出，再重新加上新的释放介质。取出的释放介质过0.45μm的滤膜，弃去初滤液之后进液相测定。

[0124]对比例1和实施例2的对比测定结果参见图4，图4为对比例1、实施例2制备出的黄体酮缓释纳米粒的体外释放曲线。[0125]从图4可以看出，对比例1和实施例2的纳米粒体外释放基本一致，与体内相差较大的区别，由于经过PEG修饰的纳米粒能够避免吞噬细胞吞噬作用从而能更加长效。[0126]取本发明实施例1、3～12、对比例2～4进行上述实验，实验结果与实施例2制得的黄体酮纳米粒的实验数据无显著差异。[0127]实施例16[0128]实验组：实施例1；[0129]对照组1：对比例——传统黄体酮纳米粒(14.58mg/kg)[0130]对照组2：市售黄体酮油溶液(2.08mg/kg)；

[0131]表14单次肌肉注射经PEG修饰的纳米粒(14.58mg/kg)与传统黄体酮纳米粒(14.58mg/kg)和连续给药7天黄体酮油溶液(2.08mg/kg)的相关药动学参数

[0132]

[0133]

可以发现经PEG修饰的黄体酮纳米粒的药时曲线下面积是市售油溶液的4.7倍；同

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时也是没有PEG修饰的纳米粒的5.9倍，并且药物半衰期也提高了220％，没有经过PEG修饰的纳米粒在肌肉注射24h基本都被吞噬细胞所吞噬而失去了作用，而经过PEG修饰的黄体酮纳米粒则可以在7天内都保持疗效，从而可以达到一次注射就能达到7天的作用，前面也提到经PEG修饰的黄体酮纳米粒即使在给药剂量减半的情况下也能达到治疗窗浓度，所以经过PEG修饰的黄体酮纳米粒在现实应用的情况下也可以更加安全。[0134]从图7可以发现在肌肉注射黄体酮纳米粒时，粒径过小(如50nm)则极易被巨噬细胞捕获吞噬，而粒径过大的粒子(如900nm)则同样有这个问题，所以通过权利要求8的方法可以制备出粒径在100—400nm的纳米粒，同时粒径也均一可控。而在此区间的纳米粒在肌肉注射之后也可以获得最好的药效。

[0135]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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图1

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图3

图4

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图5

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图6

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图7

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