高滴度慢病毒载体对T细胞亚群感染能力研究

力研究

摘要：T细胞对病毒具有重要的免疫作用，可以与CAR-T法相结合，增强对病毒的杀灭效果，实现治愈病症的目的。基于此，本文将采用实验的方法对T细胞对慢病毒的免疫效果进行分析，使其感染能力能够得到对比，使T细胞的研究更加地透彻，形成良好的病毒免疫效果。

关键词：高滴度；慢病毒；T细胞；亚群感染

引言：慢病毒对T细胞具有较强的感染能力，需要对感染能力进行研究，在高滴度条件下对其进行实验，确定慢病毒对T细胞的感染能力。分析过程需要建立在实验的基础上，这样可以保障分析结果的准确性，使实验结果能够得到充分地验证，使研究内容更加地具有理论性。

1实验准备 1.1样本选取

样本细胞采集自健康献血者，细胞具有良好的活性，可以用于实验研究过程，保障实验数据的准确性，使实验结果能够得到有效地验证。为了保障实验的有效性，需要采用同一批次的样本进行实验，避免不同样本对实验结果造成影响，使样本变量得到有效地控制。

1.2试剂

CD3/CD28磁珠、磷酸钙（CaPO4）试剂、1.5mol/LCaCl2溶液、TE缓冲液、HBS、H3PO4溶液、、PEI溶液、PEI-pro、Xfect纳米颗粒、HT1080细胞、Polybrene溶液等。

1.3仪器

Celesta流式细胞仪、荧光显微镜等。 2实验步骤 2.1慢病毒制备 2.1.1CaPO4转染

将5×10个细胞分布在8孔板上，预备2支无菌管，分别命名为试管1、试管2。在试管1中放入DNA40mg、TE缓冲液180ml。1.5mol/LCaCl230ml，将三者进行均匀混合，使各物质具有良好的分布特性。在试管3中盛放HBS235ml、H3PO45.25ml，将总量控制在250ml，使三者均匀混合。将试管1溶液导入到试管2中，再次使其均匀混合，同时等待40min，这样便实现了转染过程。

2.1.2PEI转染

将5×10个细胞分布在8孔板上，预备2支无菌管，分别命名为试管3、试管4。在试管3中放入4mg质粒溶液，使其混合均匀，再在试管3中放入15mgPEI溶液，同样均匀混合。将试管3溶液导入试管4中，均匀混合后等待20min，这样便完成了转染过程。

2.1.3PEI-pro转染

将5×10个细胞分布在8孔板上，预备2支无菌管，分别命名为试管5、试管6。在试管4中放入3mg质粒溶液，使其混合均匀，再在试管3中放入5mgPEI溶液，同样均匀混合。将试管4溶液导入试管5中，均匀混合后等待15min，这样便完成了转染过程。

2.1.4Xfect纳米颗粒转染

将5×10个细胞分布在8孔板上，预备1支无菌管，分别命名为试管7、试管8。在试管7中放入40mlXfect溶液，在试管8中放入120mlDNA溶液，将试管7溶液导入试管8中，使其均匀混合，同时等待15min，这样便完成了转染过程。

2.2慢病毒滴定

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将2×10个HT1080细胞分布在32孔板上，按照一定的倍数比对其进行稀释。稀释结束后，分别加入15mg/mlPolybrene溶液。每个24h向其中加入1次培养液，72h后对细胞的阳性率进行检测，对阳性率为0%-20%的稀释液进行滴度统计，确定HT细胞的感染情况，慢病毒滴定检测结果如图1所示。

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图1 慢病毒滴定检测

2.3T细胞活化

将健康献血者样本血液分成10份，每份为15ml，通过离心法提取核细胞（PBMC）。将核细胞进行培养，等待24h后。将3×10核细胞与30mlCD3/CD28磁珠进行混合，得到48h，使T细胞能够充分地活化，同时活化细胞进行收集。

2.4T细胞感染 2.4.1慢病毒直接感染

将3×10个活化状态的PBMC，放入600ml培养液进行培养，24h后换液。 2.4.2Polybrene促进感染

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将3×10个活化状态的PBMC，放入600ml培养液进行培养，同时加入15mg/mlPolybrene溶液，24h后换液。

2.4.3Retronectin促进感染

将3×10个活化状态的PBMC，放入600ml培养液进行培养，同时加入45mg/mlRetronectin溶液，24h后换液。

3实验结果

3.1慢病毒滴度检测

以PWPXL载体进行试验，采用PEI对病毒进行包装，使用慢性病毒对HT1080细胞进行感染。经过72h后，对感染情况进行统计，进而确定滴度检测结果。感染后的细胞可以观测到荧光效果，进而将感染细胞与未感染细胞进行区分，使感染细胞能够得到有效识别，对其进行景精确地统计。为了保证滴定结果的稳定性，需要采用同一批次的细胞进行实验，防止细胞培养过程中发生变化，使滴定检测能够得到有效控制。为了保障单病毒对单细胞进行感染，需要做好浓度稀释工作，对感染过程进行控制。经过滴度检测后，测得慢病毒的滴度为3.25×10TU/ml，说明培养液中包含3.25×10个能够引起感染的慢性病毒颗粒。

3.2慢病毒载体制备

采用不同慢病毒制备方法得到的滴定浓度是不同的，CaPO4、PEI、PEI-pro、Xfect纳米颗粒对应的滴定浓度分别为1.42×10TU/ml、1.34×10TU/ml、7.6×10TU/ml、2.36×10TU/ml。由此可见，Xfect在制备慢病毒方面要优于其它三种方式，而PEI、PEI-pro在制备慢病毒方面要优于直接制备方式。因此，为了提高慢病毒制备效率，可以采用Xfect作为制备原料。此外，质粒量对转染效率具有一定的影响，需要进一步进行实验，对其影响效果进行分析。分别取8.5mg、5.5mg、3.5mgXfect纳米颗粒进行实验，对应的滴度分别为7.74×10TU/ml、1.91×10TU/ml、6.41×10TU/ml。8.5mg质粒是5.5mg、3.5mg的4倍、10倍，说明质粒量对转染效率具有显著作用。

3.3T细胞亚群感染能力对比

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对直接感染、Polybrene、Retronectin三种感染方式进行对比，实验后测得对应的滴度分别为6.8×10TU/ml、7.21×10TU/ml、7.82×10TU/ml。Polybrene、Retronectin与直接感染相比，提升6%、15%左右，说明Retronectin感染方式要高于其它两种，具有较强的亚群感染能力。

结论：综上所述，对T细胞感染能力进行研究具有重要意义，可以确定慢病毒对T细胞的感染效果，进而对T细胞的免疫效果进行验证。CAR-T治疗肿瘤过程中，需要对T细胞进行改造，使T细胞能够更好地对病毒进行识别，进而对慢病毒起到良好的免疫效果，使慢病毒产品生产过程更加的完善。

参考文献：

[1]覃鸿妮,谢钰珍,杨晨晨,等.慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2020,41(04):29-35+45.

[2]于雅迪,李婷婷,龙颖宜,等.高滴度慢病毒载体对T细胞亚群感染能力的分析[J].免疫学杂志,2019,35(09):760-766.

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