(教师版)1.2《基因工程的基本操作程序》导学案

教师版1.2基因工程的基本操作程序(共2课时)

【学习目标】

1、简述基因工程原理及基本操作程序。

2、尝试设计某一转基因生物的研制过程。

【学习重点】基因工程基本操作程序的四个步骤。 【学习难点】

（1）从基因文库中获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因。

◆自主研习（理知识，固基础）

一、目的基因的获取：

1、目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的 。 2．获取目的基因的方法

（1）从基因文库中获取目的基因

① 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多 ，导人受体菌的群体中 ，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基因组文库：含有一种生物的 基因

② 种类 cDNA文库：含有一种生物的 基因

③ 目的基因的获取

根据基因的有关信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的 产物mRNA、基因的 产物蛋白质等特性获取目的基因。 （2）利用PCR技术扩增目的基因。

① PCR：是一项在生物体外 特定DNA片段的核酸合成技术。 ② 条件：已知目的基因的 序列。

③ 过程：目的基因DNA受热形成 ，与 结合，然后在 ____的作用下进行延伸形成DNA。

④ 方式：指数扩增=2（n为扩增循环的次数）

（3）人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。 二、基因表达载体的构建

1、表达载体的组成：目的基因+ + +标记基因等。

2、启动子：位于基因的 ，它是 结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。

3、终止子：位于基因的 ，终止 。

4、表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 给下一代；使目的基因 ____和发挥作用。

5、标记基因： 受体细胞是否含有目的基因。

6、不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。

三、将目的基因导入受体细胞

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n

（一）转化：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和 的过程。 （二）方法

1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法

① 农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，对___________植物没有感染力；Ti质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 ② 转化：目的基因插人

进入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合

到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

（2）基因枪法

基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。 （3）花粉管通道法

花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国

的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）

2．将目的基因导入动物细胞

（1）方法： 注射技术。 （2）操作程序：目的基因表达载体 3．将目的基因导人微生物细胞

（1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 （2）转化：

处理细胞→

细胞→表达载体与感受态细胞混合→

___ 细胞吸收DNA分子。 四、目的基因的检测与鉴定 1．检测

（1）方法：标记了的 （2）内容

① 检测转基因生物染色体的DNA是否插入 ② 检测目的基因是否转录 ③ 检测目的基因是否翻译成

。

。

。

、抗原抗体杂交。

→取卵（受精卵） →显微注射→注射了

_________内发育→新性状动物。

目的基因的受精卵移植到____性动物的

2．鉴定： 鉴定、抗病鉴定等。

DNA重组 转基因技术 DNA分子 DNA重组技术 限制性核酸内切酶 限制酶 黏性末端 平末端 双链DNA片段互补的黏性末端之间 T4噬菌体 黏性末端 平末端 平末端 质粒 自我 λ噬菌体的衍生物 动植物病毒 结构基因 DNA片段 储存 所有 部分 核苷酸 染色体 转录 翻译 复制 核苷酸 单链 引物 DNA聚合酶 启动子 终止子 首端 RNA聚合酶识别 尾端 转录 可以遗传 能够表达 鉴别 表达 双子叶 大多数单子叶

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T-DNA Ti质粒的T-DNA上 显微 提纯 雌 输卵管或子宫 C a 感受态 （在一定的温度下促进）感受态 “探针”与基因组DNA杂交 是否插入了目的基因 是否转录出了mRNA 蛋白质 抗虫鉴定（抗虫、抗病鉴定属于个体生物学水平鉴定）

2+

◆ 互动探究（释疑惑，升能力）

基因工程图解:抗虫棉的培育过程

探究一 目的基因的获取 问题1: 什么是目的基因?

目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，如抗虫基因，抗旱基因。 问题2: 获取目的基因的途径有哪些? 获取目的基因的常用方法有哪些? 获取方式(途径)：从已有物种中分离和人工合成 获取目的基因的常用方法：

⑴.从基因文库中获取目的基因(未知序列) ⑵.利用PCR技术扩增目的基因(已知序列)

⑶.用化学方法直接人工合成(基因比较小，已知序列) 注:

1.基因文库构建方法

直接分离法 反转录法 某种生物的全部DNA 某种生物某时期的mRNA

限制酶 反转录

一定大小的DNA片段 单链互补DNA 与载体连接 DNA 聚合酶 导入受体菌中储存 双链cDNA片段 基因组文库 与载体 连接 导入受体菌中储存

cDNA 文库

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基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因 !

2.PCR技术 原理：DNA复制

前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 条件：模板DNA( 需含有目的基因 )、四种脱氧核苷酸(dNTP)、 热稳定DNA聚合酶(Taq酶）、一对引物、温度控制 过程：

a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下,氢键断裂，形成单链DNA b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_双链 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DNA链。 d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加一倍 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 3.PCR扩增技术与DNA复制的比较 相 同 点 不 同 点 原理 原料 条件 解旋方式 场所 酶 结果 PCR技术 DNA复制 四种游离的脱氧核苷酸 模板、ATP、酶、原料、引物 DNA在高温下变性解旋 体外复制(PCR扩增仪) 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 在短时间内形成大量的DNA片段 解旋酶催化 主要在细胞核内 细胞内含有的DNA聚合酶 形成整个DNA分子 DNA复制(碱基互补配对) 4.人工合成 ⑴.反转录法:

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA（cDNA），然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获取所需的基因。 ⑵.根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 探究二 基因表达载体的构建

问题1: 为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？ 构建表达载体的目的：

（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。

问题2: 基因表达载体的构成包括哪些元件？ （绘制基因表达载体的模式图） 基因表达载体的组成：

复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因

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模式图:

问题3: 什么是启动子、终止子？各有什么作用？

启动子:

位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子

位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。

问题4: 基因工程的运载体是否必须要有标记基因？

一定需要！是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。(注意!标记基因的作用不是目的基因的检测和鉴定，而是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。)

问题5:怎样才构建基因表达载体? (填空

用一定的_________限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出____________黏性末端。用_____________同一种限制酶切断目的基因，使其产生________________相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的______切口处，再加入适量___________DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 附图

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程! 探究三 目的基因导入受体细胞---转化 问题1: 什么是转化？

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

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问题2: 比较将目的基因导入受体细胞方法？ 细胞类型 常用方法 受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法 转化过程 体细胞、受精卵 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 转入农杆菌→导入植物细胞→整合 到受体细胞的DNA上→表达 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→ 取卵（受精卵）→显微注射→早 期胚胎培养→胚胎移植→发育成为 具有新性状的动物 用Ca处理细胞→感受态细胞→重组 表达载体DNA分子与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收DNA分子 2+动物细胞 显微注射技术 微生物 Ca处理增大 细胞壁通透性 2+原核细胞细胞 或酵母菌

探究四 步骤四：目的基因的检测与鉴定——检查是否成功

问题1: 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。 问题2．目的基因的检测内容和方法的比较 类型 分子检测 步骤 第一步 检测内容 目的基因是否进入受体细胞 目的基因是否转录出mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 方法 DNA分子杂交 （DNA和DNA之间） 分子杂交技术 （DNA和mRNA之间） 结果显示 是否成功显示出杂交带 是否成功显示出杂交带 第二步 第三步 个体水平鉴定 抗原—抗体杂交 是否成功显示出杂交带 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。 问题3．试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？

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① 被细菌体内的限制性内切酶破坏。 ② 该基因指导合成的蛋白质不能在细菌体内正确修饰和表达。 ③ 细菌的RNA聚合酶不能识别真核基因的位点，致使不能启动转录。 ④ 细菌细胞中没有切除内含子转录部分的酶。

问题4． β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

拓展延伸 分子杂交技术

DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对 的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。 基因探针

基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。 附:

目的基因的检测和表达

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提示：

①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；

②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。

◆ 反馈平台（勤练习，学方法）

1、基因工程的操作步骤： ①制备重组DNA分子 ②转化受体细胞

③筛选出获得目的基因的受体细胞，培养受体细胞并诱导目的基因的表达 ④获取目的基因

正确的操作顺序是 （ C ） A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①② 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ( D )

① 从基因文库中获取目的基因 ② 利用PCR技术扩增目的基因

③ 反转录法 ④ 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A、①②③④ B、①②③ C、②③④ D、②③

3、下列属于获取目的基因的方法的是(D)

①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥D

4、有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）

A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

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D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

5、下列关于限制酶的说法正确的是 ( B ) A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少 B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键

6、已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所 指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、 d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切割后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 ( C )

A、3 B、4 C、9 D、12

7、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ C）

A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 8、下列关于基因工程的叙述，错误的是( D)

A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物

B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性

D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达 9、下列关于基因工程的叙述，正确的是： （ B ） A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B．细菌质粒是基因工程常用的运载体

C．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA D．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体

10、采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 ( C) ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养

④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 A、①② B、②③ C、③④ D、①④

11、质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( A )

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A、①是c；②是b；③是a C、①是a和b；C参是b；③是a

B、①是a和b；②是a；③是b D、①是c；②是a；③是b

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