第９卷第４期２０１１年７月生物加工过程ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＶ０１．９Ｎｏ．４Ｊｕｌ．２０１１ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０４．００７油橄榄叶中橄榄苦苷的分离纯化傅珊，万文倩，杨，胡永红（南京工业大学生物与制药工程学院，南京２１０００９）摘要：考察了６种不同大孔树脂对橄榄苦苷的吸附，筛选出吸附选择性好的Ｄ１０１大孔吸附树脂为实验材料。得到的Ｄ１０１大孔树脂的最佳吸附条件：试样上样质量浓度４１．０６ｍｓ／ｍＬ，流速５ｍｌ＿／ｍｉｎ，５０％乙醇溶液洗脱，洗脱液用量２６０ｍＬ，树脂可以反复使用。经大孔树脂富集后，橄榄苦苷的纯度可达５５％以上，再经葡聚糖凝胶精纯化后，可达７６％以上。关键词：柱层析法；大孔吸附树脂；橄榄苦苷中图分类号：Ｒ２８４．２文献标志码：Ａ文章编号：１６７２—３６７８（２０１１）０４—００３１—０４ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎｆｒｏｍｏｌｉｖｅｌｅａｖｅｓＦＵ（ＣｏｌｌｅｇｅＳｈａｈ，ＷＡＮＷｅｎｑｉａｎ，ＹＡＮＧＷｅｎｇｅ，ＨＵＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎ叫ｉｎｇＹｏｎｇｈｏｎｇｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｆｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎ肌ｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｍｐｅｉｎｉｎｏｌｉｖｅｌｅａｆｆｅｒｅｎｔｍａｃｒｏｐｏｍｓｒｅｓｉｎｓ。Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒｅｓｉｎｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｆｏｒｍａｎｃｅｓ．Ｔｏａｃｈｉｅｖｅａｌｌｅｘｔｒａｃｔｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙ６ｄｉｆ－ｐｅｒ－ｏｎａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｏｐｔｉｍａｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ，ｔｈｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｂｅｓｔｒｅｓｉｎｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｌｕｎｌｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｍａｃｍｐｏｍｕｓｒｅｓｉｎＤ１０１ｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅＩｌ瑚ｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎｉｎｔｈｅｌｉｑｕｉｄｗａｓ４１．０６ｍｇ／ｍＬ，ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ５ｍＬ／ｍｉｎ，５０％ａｑｕｅｏｕｓｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｏｌｖｅｎｔｆｏｒｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｔｈｅｖｏｌｕｍｅｏｆｅｌｕｅｎｔＷａｓ２６０ｍＬ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ５５％，ｔｈｅｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎＷａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｐｕｒｌ—ｗａｓｆｉｃａｔｉｏｎａｇａｉｎｕｓｉｎｇＳｅｐｈａｄｅｘ，ａｎｄ７６％ｙｉｅｌｄｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｈｎｍｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ；ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ橄榄苦苷（ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ，简称ＯＥ）是一种重要的苯酚类裂环环烯醚萜苷类化合物…，广泛存在于木犀科的木犀榄属（油橄榄Ｏｌｅａｅｕｒｏｐａｅａ）、丁香属（野丁香Ｓｙｒｉｎｇａｖｕｌｇａｒｉｓ）、女贞属（日本女贞Ｌｉｇｕｓ—ｔｒｕｍｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｍｂ）和木犀属（齿叶木犀Ｏｓｍａｎ－ｔｈｕｓｆｏｒｔｕｎｅｉＣａｒｒ）等多种植物中心Ｊ。橄榄苦苷具有极强的抗氧化能力，能减慢低密度脂蛋白的氧化程度，还可以预防冠心病、动脉粥样硬化，也能舒缓血管平滑肌和降低血压”Ｊ，多被用于保持肌肤弹性和柔嫩，防止老化，重现肌肤光滑，在国外的很多知名化妆品中均有所添加ＨＪ。由于橄榄苦苷可用于食品、医药、化妆品行业中，其需求量也在逐年增长。因此分离纯化橄榄苦苷有效成分成为近年来的研究热点。目前科研工作者已在有机溶剂提取法等传统技术的基础上，开发了多种新型提取纯化的方法，例如超临界提取收稿日期：２０１０一１２一０９基金项目：江苏省高校自然科学基础研究项目（０８ＫＩＡ５３０００２）作者简介：傅珊（１９８２一），女，天津人，硕士，研究方向：工业生物技术；胡永红（联系人），教授，Ｅ。ｍａｉｌ：ｈｙｈ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ万方数据３２生物加工过程第９卷法、膜分离法、大孑Ｌ吸附树脂分离法和层析分离法等∞Ｊ，而大孔树脂是２０世纪７０年代末发展起来的一种有效的分离纯化技术。笔者通过对比多种树脂对橄榄苦苷的分离纯化效果，再采用葡聚糖凝胶进行精纯化，提高橄榄苦苷的含量，以期为工业化生产较高纯度的橄榄苦苷奠定一定的基础。１材料与方法１．１材料油橄榄叶提取物，购自甘肃陇南油橄榄叶生产基地。ＤｉａｉｏｎＨＰ—１０树脂，日本三菱合成工业公司；Ｄ１０１大孔树脂，安徽三星树脂科技有限公司；ＡＢ一８树脂，天津南开波鸿树脂科技有限公司；ＨＰＤ一１００和ＨＰＤ～３００树脂，沧州宝恩化工有限公司；Ｘ一５树脂，天津南开大学化工厂；葡聚糖凝胶Ｇ一２５，长征制药厂；无水乙醇、醋酸、ＮａＣＩ、ＨＣＩ，均为市售分析纯。１．２仪器ＤＩＯＮＥＸＳｕｍｍｉｔＰ６８０型高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ），美国戴安公司；ＫＱ一１００型超声仪，昆山市超声仪器有限公司；ＳＥＮＣＯ—Ｒ型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；ＧＺＸ一９０３０ＭＢＥ型数显鼓风干燥箱，上海实业有限公司医疗设备厂。１．３方法１．３．１树脂的预处理旧’将新购树脂先用适量的９５％乙醇充分浸泡１２ｈ，再用蒸馏水洗涤至无醇味、不浑浊。然后用４００ｍＬ５％ＨＣＩ溶液搅拌浸泡３ｈ，用蒸馏水洗至ｐＨ为中性。４００ｍＬ５％ＮａＯＨ溶液搅拌浸泡３ｈ，最后用蒸馏水洗至ｐＨ为中性。１．３．２橄榄苦苷试样的制备称取５．０ｇ油橄榄叶提取物置于１００ｍＬ无水乙醇中，在５０℃恒温水浴中充分溶解１２ｈ，然后抽滤旋蒸并回收溶剂，作为树脂吸附原液备用，油橄榄叶提取物质量浓度为８２．３ｍｇ／ｍＬ。１．３．３树脂的静态平衡实验¨Ｊ根据橄榄苦苷的物理化学性质和大孔树脂的吸附性能，选用ＡＢ一８、ＤｉａｉｏｎＨＰ一１０、ＨＰＤ一１００、Ｄ１０１、ＨＰＤ一３００和Ｘ一５共６种型号的树脂进行实验。称取预处理过的树脂２．０ｇ，置于具塞磨口三角瓶，加入橄榄苦苷提取液３０ｍＬ，室温下恒温振荡进万方数据行吸附，定时取样测定剩余液中橄榄苦苷的质量浓度。然后将达到吸附平衡的树脂滤出，用３０ｍＬ７０％的乙醇在室温下振荡进行解吸，定时测定解吸液中橄榄苦苷的质量浓度，计算平衡吸附量和解吸率。饱和吸附量＝［Ｐ（吸附前）一Ｐ（吸附后）］×Ｖ（溶液）／ｍ（干树脂）（１）解吸量＝ｐ（解吸液）×Ｖ（解吸液）／ｍ（干树脂）（２）解吸率＝解吸量／饱和吸附量×１００％（３）１．３．４大孔吸附树脂的初步纯化实验准确称取１００．０ｇ预处理过的Ｄ１０１大孔吸附树脂，装入玻璃层析柱（２．６ｃｍ×５０ｃｍ）中，将一定浓度的橄榄苦苷提取液缓慢注入柱中，循环吸附３ｈ，然后分体积收集流出液，每２０ｍＬ收集ｌ管，检测流出液中橄榄苦苷的质量浓度。树脂吸附完全后，用一定体积的洗脱剂以一定的流速进行解吸，检测解吸液中橄榄苦苷的含量。考察上样液质量浓度、解吸量等因素对树脂吸附和解吸性能的影响，确定合适的吸附及解吸工艺条件。１．３．５葡聚糖凝胶的再纯化实验称取４０．０ｇ葡聚糖凝胶Ｇ一２５，加适量蒸馏水，搅拌均匀并加热溶胀２ｈ。然后用蒸馏水反复洗涤多次，去除凝胶上层水及细小颗粒，湿法装柱（１．０ｃｍ×１００ｃｍ）。将经过大孔树脂后的试样旋蒸浓缩，去除乙醇后经葡聚糖凝胶柱分离。洗脱液为蒸馏水，流速为ｌｍＬ／ｍｉｎ，每１０ｍＬ收集１管，用ＨＰＬＣ进行检测。１．３．６检测方法¨１采用ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８（咖４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５“ｍ）色谱柱，流动相ｙ（乙腈）：Ｖ（水，含１．Ｏ％醋酸）＝２２：７８，检测波长为２７８ｎｍ，流速１ｍＬ／ｍｉｎ。对橄榄苦苷进行检测。２结果与讨论２．１大孔吸附树脂的选择考察ＡＢ一８、ＤｉａｉｏｎＨＰ—１０、ＨＰＤ一１００、Ｄ１０１、ＨＰＤ一３００和Ｘ一５共６种型号的树脂对橄榄苦苷的吸附效果。在相同的条件下，测得各树脂的静态吸附结果，如表ｌ所示。由表ｌ可知：Ｄ１０１和ＡＢ一８树脂对橄榄苦苷的解吸效果较好，解吸率均达到５５％以上，其中Ｄ１０１的饱和吸附量较大。ＨＰＤ一１００、ＨＰＤ一３００树脂的解吸率相对较小；Ｘ一５的吸附量较大，在实验中容第４期傅珊等：油橄榄叶中橄榄苦苷的分离纯化３３易造成有效成分的损失。综合考虑吸附量及解吸率的影响，选择Ｄ１０１大孔吸附树脂对橄榄苦苷进行分离纯化，并进一步优化工艺条件。表１树脂静态解吸率的测定Ｔａｂｌｅ１Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆ６ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｓ２．２大孔吸附树脂的初步纯化工艺２．２．１上样液质量浓度对吸附效果的影响取处理后的树脂３份，湿法装柱，再取橄榄苦苷上样液３份（每份５０ｍＬ），分别用水稀释到２、３和４倍后上柱，过柱后收集流出液，检测其中橄榄苦苷的残留量。上样液不同的质量浓度对树脂吸附的影响如表２所示。表２上样液质量浓度对吸附效果的影响Ｔａｂｌｅ２Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｓａｍｐｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎ从表２可以看出：上样液中含有橄榄苦苷的总量虽然相同，但体积和浓度不同，使树脂对橄榄苦苷的吸附产生影响。４倍上样液体积时，橄榄苦苷的残留量（未被吸附量）最大，占３．１９％；而上样液为２倍体积时，损失最小，残留量为２．３２％。由此可见，提高上样液质量浓度有利于树脂对橄榄苦苷的吸附。因此，选用１００ｍＬ（即上样液为２倍体积）的上样液进行实验操作。２．２．２解吸液浓度的选择采用乙醇一水作为解吸液的体系。取适量橄榄苦苷上样液上柱，待吸附完全后，分别用２倍柱体积、体积分数为１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％和９０％的乙醇进行解吸，收集流出液，检万方数据测其中橄榄苦芹的含量，结果见图ｌ。０１０２０３０４０５０６０７０８０９０１００妒（乙醇匀／％图ｌ乙醇浓度对解吸效果的影响Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｔｅｎｔｏｎｅｌｕｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ从图１可以看出：用不同浓度的乙醇进行解吸，对橄榄苦苷的质量浓度有比较明显的影响。随着乙醇浓度的增大，橄榄苦苷的含量随之增加。虽然以６０％、７０％的乙醇浓度进行解吸得到的橄榄苦苷含量很高，但残留的杂质也较多，致使橄榄苦苷的纯度较低。因此，综合考虑采用５０％的乙醇溶剂进行解吸实验。２．２．３洗脱流速的确定将处理后的树脂分为４份，湿法装柱进行完全吸附，然后分别以３、４、５、６ｍＬ／ｍｉｎ的流速进行洗脱。收集洗脱液并利用ＨＰＬＣ检测橄榄苦苷的含量，结果见图２。３．６ｉ、３．２Ｅ２．８∞２．４喜２．０址１．６＝｝｝￡１．２勒０４０８０１２０１６０２００２４０２８０３２０收集体积，ＩｎＬ图２流速对橄榄苦苷的解吸影响Ｆｉｇ．２Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｅｌｌｏｎｅｌｕｔｉｏｎｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ从图２可以看出：随着上样液流速的提高，收集液中橄榄苦苷的质量浓度有明显的增加。流速为３和４ｍＬ／ｍｉｎ时，橄榄苦苷的质量浓度变化不明显，而流速为５和６ｍＬ／ｍｉｎ时，对橄榄苦苷有很大的影响。但选择上样液流速也要同时考虑树脂对橄榄苦苷的吸附能力，综合考虑后选择上样流速为５ｍＬ／ｍｉｎ。２．２．４洗脱剂用量的确定取处理好的大孑Ｌ吸附树脂湿法装柱，待橄榄苦生物加工过程第９卷苷试样吸附达饱和后，用４８０ｍＬ５０％乙醇进行解从图３可以看出：橄榄苦苷的高质量组分集中在４０～２６０ｍＬ之间，因此只需２６０ｍＬ解吸液就可以将橄榄苦苷解吸下来。合并较高质量浓度的解吸。洗脱流速控制在４ｍＬ／ｍｉｎ，每４０ｍＬ收集一次，用ＨＰＬＣ检测橄榄苦苷的质量浓度，并绘制解吸曲线，结果如图３所示。一２．４吸液，得平均吸附解吸率达９５％以上。由此说明，Ｄ１０１大孔树脂对橄榄苦苷有较好的富集作用。２．３葡聚糖凝胶的再纯化根据１．２．５的方法进行操作，对经过葡聚糖凝胶层析柱再纯化后的橄榄苦苷组分进行ＨＰＬＣ检测，其相对质量分数可达到７６％左右。分离纯化前｛２．０∞１．６器１．２錾ｏ．ｓｑ肇０．４Ｏ４０８０１２０１６０２００２４０２８０３２０后的橄榄苦苷试样谱图如图４所示。从图４可以看出：橄榄苦苷经大孔树脂和葡萄糖凝胶的纯化后，杂质含量明显下降，说明Ｄ１０１大孔树脂和葡萄糖凝胶Ｇ一２５对橄榄苦苷成分具有良好的分离纯化作用。¨流出组分）／ｍＬ图３橄榄苦苷的解吸曲线Ｆｉｇ．３Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ橄榄苦苷ｊ０５１０ｔ／ｍｉｎ１５２０Ｏ５ｌＯｔ／ｍｉｎ１５加２５（ａ）纯化前（ｂ）纯化后图４分离纯化前和后的试样色谱Ｆｉｇ．４Ｓａｍｐｌｅｓｏｆｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ３４２－３４８．３结论根据静态吸附和吸附工艺条件的实验，确定ｒｌ２１Ｊ王成章，高彩霞，叶建中，等．引种阿斯油橄榄叶中橄榄苦苷提取分离及结构鉴定［Ｊ】．林业化学与工业，２００９，２９（３）：５３－５７．Ｄ１０１型大孔吸附树脂纯化橄榄苦苷的最佳工艺：上ｒＬ３１ＪＦａｔｉｍａＰＭ，ＭｉｃｈａｅｌＨＧ，ＰａｕｌａＧ．ＡｃｔｉｖｉｔｙｏｉｌｐｈｅｎｏｌｉｃａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｉｎｏｆＬｉｐｉｄｓ。２００３．１２４：２３－３６．ａｎｄｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｏｌｉｖｅＰｈｙｓｉｃｓ样液质量浓度４１．０６ｍｇ／ｍＬ，洗脱流速５ｍＬ／ｍｉｎ，用５０％乙醇溶液进行洗脱，洗脱液用量２６０ｍＬ可得到较高纯度的橄榄苦苷；经过葡聚糖凝胶再纯化后，橄榄苦苷的相对质量分数可达到７６％以上，且树脂ｒＬ４１Ｊｌｉｐｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ郝婷，崔建玲，赵桂琴，等．橄榄苦苷提取分离和药理活性的研究进展［Ｊ］．承德医学院学报，２０１０，２７（１）：６９－７２．可能反复使用。用乙醇提取橄榄苦苷具有操作简单，污染小，易于实现工业化等特点，为橄榄苦苷的工业化生产提供了可行的方案。５１Ｊ李爱红，刘长占．天然产物中活性成分提取技术研究进展［Ｊ］．承德石油高等专科学校学报，２００３，５（４）：２９－３３．６１Ｊ朱兴一，戴春伟，谢捷，等．一种采用大孔吸附树脂纯化茶多酚的方法［Ｊ］．食品科技，２０１０，３５（８）：２５１－２５４．参考文献：［１］ＥｖｒｅｎＡ，ＤｅｎｉｚＢ，ＯｇｕｚＢ，ｅｔａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓｆｒｏｍｔｈｅｏｆｏｌｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｓｌｅａｖｅｓ（ＯｌｅａｅｕｒｏｐａｅａＬ．）ｂｙａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄＰｕｆｉｆｉｅａｔｉｏｎＯｌｌｓｉｌｋ７李红冰，唐玲，陈跃龙，等．Ｄ１０１型大孔吸附树脂纯化油茶皂苷的工艺研究［Ｊ］．中国药方，２００９，２０（１２）：９００－９０１．８．１邹庐泉，唐杰，王欢，等．高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）在天然产物中的应用［Ｊ］．宁波化工，２００９（１）：２７－３１．ｆｉｂｒｏｉｎ［Ｊ］．ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，６２：万方数据油橄榄叶中橄榄苦苷的分离纯化
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
傅珊， 万文倩， 杨， 胡永红， FU Shan， WAN Wenqian， YANG Wenge， HU Yonghong南京工业大学生物与制药工程学院,南京,210009生物加工过程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering2011,09(4)
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