漆酶的性质_功能_催化机理和应用

漆酶的性质、功能、催化机理和应用

王国栋 陈晓亚

º

(中国科学院上海生命科学研究院,植物生理生态研究所 上海 200032)

¹

摘要 漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白,是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员。本文叙述漆酶的分子结构、底物特异性及其物理化学特性,并讨论漆酶的酶促反应机理和生物学功能,包括植物漆酶参与细胞壁的形成以及漆酶与病原菌毒力的关系。本文还着重介绍了漆酶在环境生物修复方面的应用。关键词 漆酶,病原菌毒力,生物修复,功能,催化机理

TheProperties,Functions,CatalyticMechanismand

ApplicabilityofLaccase

WANGGuo_Dong CHENXiao_Yaº

(InstituteofPlantPhysiologyandEcology,ShanghaiInstitutesforLifeSciences,CAS,Shanghai200032)

Abstract Laccasebelongstothefamilyofmulticopperoxidases.Inthisreview,themolecularstructure,substratespecificity,catalyticmechanismandotherphysicochemicalparametersoflaccase

aresummarized.Theroleoflaccaseinplantcellwallformationandpathogenvirulencearedis2cussed.Forapplications,wepayspecialattentiontothepotentialoflaccaseinbioremediation.Keywords Laccase,Pathogenvirulence,Bioremediation,Function,Catalyticmechanism

漆酶(EC1.10.3.2)由于首次从日本漆树(Rhusvenicifera)的汁液中分离而得名,漆酶属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员,该蛋白家族还包括人体血浆铜蓝蛋白(EC1.10.3.1)和植物抗坏血酸氧化酶(EC1.10.3.3),其中漆酶的结构最简单。三者的催化机理雷同,都是在从底物吸收电子的同时将作为第二底物的氧分子还原成水。漆酶的活性位点,除了结合铜离子外,还可以结合底物、水合电子和分子氧。漆酶具有底物广泛,催化活性高等特性,因而在有机合成、生物传感器及工业上有广泛的应用。

1 漆酶的来源和特性

1.1 来源

漆酶广泛存在于植物和真菌中,有关真菌漆酶的研究与应用已有大量报道。但高等植物漆酶的报道相对较少,研究最为详尽的是日本漆树(Huttermannetal,2001),在日本漆树分泌的汁液中,有60%~65%的漆酚(urushiol)、6.5%~10%的糖分、20%~25%的水,漆酶所占的比重可达0.1%~1%。由于漆酚的毒性非常大,所以漆树的汁液经常被用来研究植物对真菌和昆虫的防卫反应,在有氧气存在的条件下,漆树的汁液会变成韧性很强的固体,保护伤口,除了空气的直接氧化作用外,漆酶氧化漆酚形成高聚物对汁液的

¹国家自然科学基金(30030020),中国科学院院知识创新工程重要方向项目(KSCX2_SW_313)。º通讯作者。Authorforcorrespondence.E_mail:xychen@iris.sipp.ac.cn 收稿日期:2003203208 接受日期:2003206209 责任编辑:孙冬花470 植物学通报20卷

固化起了非常重要的作用。除了漆树科植物外,漆酶在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、松树(Pinustaeda)、黄杨(Populustrichocarpa)和欧亚槭树(Acerpseudolan2tanus)等物种中也有报道,我们实验室从棉花的cDNA文库中也分离到两个漆酶cDNA,所以结合已有文献我们可以肯定漆酶在高等植物中也是广泛存在的。

基因组测序和生物信息学的飞速发展为生物科学注入了新鲜血液和强大动力。模式植物拟南芥基因组测序已经完成,我们在www.arabidopsis.org网站上搜索发现拟南芥基因组有17个漆酶基因(TheArabidopsisGenomeInitiative,2000),分别位于三条染色体上:5个位于2号染色体,2个位于3号染色体,10个位于5号染色体。在我国科学家和世界同行的共同努力下,水稻基因组测序工作进展很快。我们发现已完成测序水稻基因组中也含有数个漆酶基因。Unigene(www.ncbi.nlm.gov.org)搜索水稻基因组数据库发现共有6个漆酶基因片段,26条相关表达序列标签(EST)。由此可见漆酶在单子叶和双子叶植物中可能都存在一个较为复杂的基因家族。

1.2 漆酶的分子特征

漆酶是一种糖蛋白,肽链一般由500个左右氨基酸组成,糖配基占整个分子的10%~45%。糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异,漆酶的分子量随来源不同会有很大差异,甚至来源相同的漆酶分子量也会不同(Yaropolovetal,1994)。1.3 漆酶的生化特性

漆酶能催化许多化合物的氧化反应,底物比较广泛,包括许多与对二酚结构类似的化合物,如氨基苯酚,邻、对苯二酚,多酚,多胺,木质素和芳基二胺等。一些漆酶能高效地氧化抗坏血酸,另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。必须注意的是过氧化物酶和其他一些多酚氧化酶也可以催化类似的反应,但这些酶不会利用分子氧作为第二底物,因此测定催化反应中氧吸收速率可以作为漆酶活性的可靠证据。漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂,有卤化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等,离子强度的不同也会影响酶的活力。不同来源的漆酶最适pH范围不同:CoriolushirsutuspH3.5~4.5,SchinusmollepH6.2,RhizoctoniapraticolapH6.0~7.0,CoriolusversicolorpH4.0~5.0(Yaropolovetal,1994)。

2 漆酶活性位点结构及反应机理

尽管漆酶的氨基酸序列同源性差异很大,一般不同来源的漆酶同源性低于50%,但其催化位点序列还是非常保守的。通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究,发现漆酶具有3个铜离子结合位点(T1,T2,T3),共结合有4个铜离子,根据它们的氧化还原电势、光学和磁学特征划分为三种类型(SakuraiandSuzuki,1997)。

第一类铜离子(Cu1)能与包括水在内的溶剂作用,各种铜离子络合剂能将其除去导致酶的活性大大减少,在X_射线研究漆酶蛋白晶体结构时常用汞取代Cu1。Cu1的电子顺磁共振光谱(electronicparamagnetresonance,EPR)在可见区显示4条电子转移条带,其中由CysyCu1产生的条带最强(614nm,E=5800#mol-1#L-2#cm-1),是漆酶产生蓝色的主要原因,并且有非常狭窄的超精细裂分(A=4.3@10#cm)。Cu1和4个配体形成扭曲四-3

-1

4期王国栋等:漆酶的性质、功能、催化机理和应用 471

面体几何构型。

第二类铜离子(Cu2)是由两分子的咪唑和一分子的水配位形成松散的扭曲四面体几何构型,所以很容易除去,有氧条件下则不易除去。EPR光谱有非常宽的超精细裂分(A

=20.6@10-3#cm-1)。无氧条件下,如果有还原剂而没有二乙基二硫氨基甲酸酯(DDC)或二甲基乙二圬存在,EDTA等不能把铜离子螯合除去。

第三类铜离子(Cu3a,Cu3b)与三个组氨酸分子和一个氢氧化物分子形成受阻四面体几何构型,在有氧分子存在时,这对铜离子由氢氧化物为桥结合在一起,Cu_Cu共价体产生强烈的反铁磁性,检测不到EPR光谱信号。这类二价复合物在330nm处的吸收随活性位点的还原而消失。

漆酶晶体X_射线衍射显示:Cu2和Cu3被定位于0.4nm的空间内形成三核结构(T2/T3)。推测的漆酶催化机理是T1活性位点的铜离子从还原态的底物吸收电子,底物被氧化形成自由基,进而导致各式各样的非酶促次级反应如羟化、歧化和聚合等。同时T1活性位点的铜离子吸收的电子传递到三核中心的铜离子,分子氧在那里被还原成水。还原氧分子到水是经过了两步双电子反应,第一步形成超氧化物过渡体,第二步再生成水(Zoppellaroetal,2001;Torresetal,2002)。

3 漆酶的功能

3.1 植物漆酶的功能

作为高等植物的显著结构特点之一的细胞壁,尤其是木质素的合成越来越引起人们的注意。木质素是指在植物细胞壁氧化聚合木质素单体而形成的高聚物。长期以来,植物细胞壁丰富的过氧化物酶被认为是催化木质素单体氧化聚合的首要酶。最近的研究表明,漆酶分泌到植物细胞次生壁,在有氧气存在时,可以催化同样的聚合反应。漆酶参与高等植物木质素合成的假说是由Freudenberg等(1958)提出的,其实验依据是真菌漆酶在体外可以催化木质素单体形成与木质素化学降解结构相同的二聚体。该理论曾因无法在一些植物组织中发现漆酶而一度被弃用。直至Sterjiades等(1992)从欧亚槭树(Acerpseu2dolantanus)中分离得到漆酶,并证明其可以体外催化木质素单体的氧化聚合,漆酶参与木质素合成的可能性再次提出。Sterjiades等还认为漆酶是参与木质素单体氧化聚合形成寡聚物,而过氧化物酶则参与后期形成高聚物的反应。Bao等(1993)在研究火炬松(Pinustaeda)的漆酶时也得出了漆酶与木质素合成相关的结论。由于植物体内的木质素是有旋光性的,而漆酶体外催化木质素单体形成的产物为消旋体,所以一些学者通过研究认为漆酶是在一些辅助蛋白(dirigentprotein)的作用下参与木质素的合成,以保证酶促反应产物的立体选择性(Davinetal,1997;HatfieldandVermerris,2001;Lewisetal,1998)。到目前为止,利用功能获得或缺失的遗传学方法来研究木质素合成途径中酶的功能已不乏先例,Ranocha等(2002)利用反义RNA技术不同程度地抑制黄杨(Populustrichocarpa)中三个漆酶基因lac3、lac90和lac110的表达:其中lac3AS反义植株几乎检测不到内源lac3表达,导致转反义植株可溶性酚类含量较野生型提高了1~2倍,光学和电子显微镜下观察表明:转基因植株茎秆的木质部纤维细胞壁发生了剧烈变化,个别细胞严重变形解体,作者推测lac3功能与黄杨木质部纤维细胞壁形成相关。472 植物学通报20卷

植物中广泛存在的过氧化物酶会对漆酶的活性测定造成干扰,而且漆酶在植物体内形成多成员家族,功能冗余以及其底物的广泛性都使得漆酶在植物体内的功能难以准确地鉴定。所以尽管已经有许许多多相关的实验数据,但大多是漆酶的体外生化数据和基因表达特征分析,尚不能对漆酶在木质素合成中的作用下一个明确的结论。我们目前只能说漆酶参与高等植物细胞壁的形成。

种种研究证据表明植物漆酶还具有其他生物学功能。在高等植物的防御反应中漆酶起一定作用,如在某些植物伤口分泌的汁液中漆酶参与催化氧化反应以促进伤口的愈合。DeMarco和Roubelakis_Angelakis(1997)还提出漆酶在植物体内可能参与含有酪氨酸蛋白之间的交联。Li和Steffens(2002)以35S启动子驱动土豆漆酶基因在番茄(Solanumtubero2sumL)中过量表达,改变了番茄体内氯原酸等酚类物质的含量,而且使转基因番茄对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringepvtomato)的抗性显著提高。我们实验室将棉花漆酶基因在拟南芥中过量表达,发现转基因拟南芥对酚酸类物质的抗性明显增强,内在的抗性机制正在研究中。

3.2 漆酶与病原菌毒力

漆酶的活性与真菌的出芽、色素生成、木质素降解和病源发生相关,同时漆酶还可以保护真菌病原菌免受寄主植保素和鞣质等化合物的影响(Pezetetal,1992),所以漆酶被认为是重要的病原菌毒力因子。例如根病原菌Heterobasidionannosum的侵染性和漆酶的出现紧密相关(Johanssonetal,1999)。

Nuss实验室在系统研究板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)的致病机理过程中发现,病毒双链RNA(HAVds_RNA)侵染板栗疫病菌会造成真菌的致病力下降,低毒力菌株同时有抑制孢子产生、色素积累改变、纤维素酶活性下降等表型(Anagnostakis,1984;Elliston,1978;Hillmanetal,1990)。随后对由此产生的低毒力菌株(EP_713)研究发现:漆酶(LAC1)的活性及其mRNA水平都大大下降。漆酶活性下降与真菌毒力下降有直接关系(Choietal,1992)。目前从板栗疫病菌分离了三个漆酶基因:LAC1、LAC2、LAC3,其中1和3是胞外酶,2是胞内酶。这三种漆酶的体内功能还不清楚,但Kim等(1995)认为,在板栗疫病菌侵染发病的部位,丹宁酸作为一种植物防卫素,含量丰富,漆酶的存在可以使病菌对丹宁酸的抗性提高,增强感病力。至于双链RNA在真菌体内如何漆酶转录的研究仍在进行中,可能与G_蛋白信号传导途径相关(Kasaharaetal,2000)。

漆酶还与人的病原真菌致病性相关,一项比较系统的工作是对新型隐球菌(Crypto2coccusneoform)毒力机理的研究(Liuetal,1999a;1999b;Nosanchuketal,2000;Zhuetal,2003)。

4 漆酶与生物修复

由于漆酶具有底物广泛、活性高、寿命长等特点,目前已被应用于造纸及印染脱色等许多行业(MayerandStaples,2002)。这里着重介绍漆酶在生物修复(bioremediation)方面的应用。

环境污染是当今人类面临的最严重的问题之一,上世纪60至70年代全球范围内过度使用农药尤其是含氯的芳香类化合物(例如三氯苯酚),造成严重的环境污染。工业废4期王国栋等:漆酶的性质、功能、催化机理和应用 473

水大量排放,仅印染行业每年要排放费染料近七万吨,对人类的生存环境造成极大的破坏。

生物修复是利用生物的方法来修复被人类长期生产和生活活动所污染和破坏的局部

环境,使之重现生机的过程。生物修复技术具有就地处理,操作简单,处理效果好且污染物转化后无二次污染等众多优点。在生物修复过程中,目前主要是应用真菌等微生物,这一方面是由于真菌降解污染物的潜力巨大,另一方面也因为其在环境中可以保持较高的活性。生物除污是目前研究领域的热点,并取得了一些可喜的进展。从真菌中提取的漆酶可以降解多种环境污染物,已应用的漆酶大多为胞外酶,常用的漆酶高产菌株有Pycno2poruscinnabarinus(WongandYu,1999),用于漆酶基因工程的表达酵母菌株是Pichiapas2toris(Geloetal,1999)。

在革耳菌(Panustigrinus)和彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)的培养基中加入2,4,6_三氯苯酚,两种真菌都可以将2,4,6_三氯苯酚转变成2,6_二氯_1,4_二羟喹啉和2,6_二氯_1,4_二羟苯醌,参与催化反应的酶可能还包括过氧化物酶(Leontievskyetal,2000;2002),但两种真菌的酶调节模式有所不同。从红菌(Trametesvillosa)中分离的漆酶可以降解二酚A(bisphenolA),二酚A是一种会引起内分泌紊乱的化学物质(Fukudaetal,2001)。当反应体系中加入电子介导剂1_羟基苯并(1_hydroxybenzotriazole,HBT)会导致酶促效率大大提高,主要反应产物是4_异丙烯基酚(Tsutsumietal,2001)。从红菌另外一个种(Trameteshirsute)分离的漆酶可以降解偶氮、靛蓝、三苯甲烷等23种工业染料(Rodriguezetal,1999)。

不过,真菌微生物往往存在生长太慢,代谢活性不高的缺点,许多学者在提高漆酶的稳定性和电子介导剂的使用方面作了大量有益的尝试。将漆酶固定在铝板等固体介质上可以提高酶的寿命、稳定性及对活性抑制剂的抗性(Abadullaetal,2000),电子介导剂在酶促反应中起/电子穿梭载体0作用,提高催化效率。目前漆酶应用中使用比较多的电子介导剂是3_乙基苯并噻唑_6_磺酸(ABTS)、1_羟基苯并和2,2,6,6_四甲基哌啶_1_氧自由基(TEMPO)等,在电子穿梭载体的作用下酶解效率可提高几倍到几十倍不等(Acunzoetal,2002;Fabbrinietal,2002)。

5 展望

综合目前已有的文献,漆酶是一种多功能的酶,可催化的反应多种多样,但机理都是漆酶催化底物产生自由基,自由基再进行次级反应。真菌中漆酶研究比较系统,商业应用和体内的分子机制将是今后的研究热点。高等植物漆酶可能与细胞壁的形成(木质素合成)、抗病、对环境的适应等过程相关,但其生物学和生理学功能还有待深入研究。可以预见,一方面在今后一段时间内漆酶的主要研究方向仍将集中在应用方面。另一方面,模式植物基因组信息和转基因技术将大大促进植物漆酶功能与表达机制的研究。

参考文献

AbadullaE,TzanovT,CostaS,RobraKH,CavacoPA,GuebitzGM,2000.Decolorizationanddetoxificationoftextiledyeswith

474 植物学通报

alaccasefromTrameteshirsute.ApplEnvironMicrob,66:3357~3362

20卷

AcunzoF,GalliC,MasciB,2002.Oxidationofphenolsbylaccaseandlaccase_mediatorsystems.EurJBiochem,269:5330~

5335

AnagnostakisSL,1984.ThemycelialbiologyofEndothiaparasiticaI.Nuclearandcytoplasmicgenesthatdeterminemorphologyand

virulence.In:JenningsDH,RaynerADMeds.TheEcologyandPhysiologyoftheFungalMycelium.Cambridge:CambridgeUniversityPress,353~366

BaoW,OcMalleyDM,WhettenR,SederoRR,1993.Alaccaseassociatedwithlifgnificationinloblollypinexylem.Science,260:672~674

ChoiGH,LarsonTG,NussDL,1992.Molecularanalysisofthelaccasegenefromthechestnutblightfungusandselectivesuppres2

sionofitsexpressioninanisogenichypovirulentstrain.MolPlantMicrobeIn,5:119~128

DavinLB,WangHB,CrowellAL,BedgarDL,MartinDM,SarkanenS,LewisNG,1997.Stereoselectivebimolecularphenoxy

radicalcouplingbyanauxiliary(dirigent)proteinwithoutanactivecenter.Science,275:362~366

DeMarcoA,Roubelakis2AngelakisKA,1997.Laccaseactivitycouldcontributetocell_wallreconstitutionofregeneratingprotoplas2

ts.Phytochemistry,46:421~425

EllistonJE,1978.PathogenicityandsporulationinnormalanddiseasedstrainsofEndothiaparasiticainamericanchestnut.In:

MacDonaldWAed.AmericanChestnutSymposiumProceedings.Morgantown,WV:WestVirginiaUniversityPress,95~100FabbriniM,GalliC,GentiliP,2002.Comparingthecatalyticefficiencyofsomemediatorsoflaccase.JMolCatalB_Enzym,16:

231~240

FreudenbergK,HarkinJM,RechertM,FukuzumiT,1958.Dieandderverholzungbeteiligtenenzymediedehydrierungdessinapyl

alkohol.ChemBer,91:581~590

FukudaT,UchidaH,TakashimaY,UwajimaT,KawabataT,SuzukiM,2001.DegradationofbisphenolAbypurifiedlaccasefrom

Trametesvillosa.BiochemBiophResCo,284:704~706GeloPM,KimHH,ButlinNG,PalmoreGTR,1999.ElectrochemicalstudiesofatruncatedlaccaseproducedinPichiapastoris.

ApplEnvironMicrob,65:5515~5521

HatfieldR,VermerrisW,2001.Ligninformationinplants:thedilemmaoflinkagespecificity.PlantPhysiol,126:1351~1357HillmanBI,ShapiraR,NussDL,1990.Hypovirulence_associatedsuppressionofhostfunctionsinCryphonectriaparasiticacanbe

partiallyrelievedbyhighlightintensity.Phytopathology,80:950~956

HuttermannA,MaiC,KharazipourA,2001.Modificationofligninfortheproductionofnewcompoundedmaterials.ApplMicrobiol

Biot,55:387~394

JohanssonM,DenekampM,AsiegbuFO,1999.ProductionandisozymepatternofextracellularlaccaseintheSandPintersterility

groupsoftherootpathogenHeterobasidionannosum.MycolRes,103:365~371

KasaharaS,WangP,NussDL,2000.Identificationofbdm_1,ageneinvolvedinGproteinB_subunitfunctionanda_subunitaccu2

mulation.ProcNatlAcadSciUSA,97:412~417

KimDH,RiglingD,ZhangL,vanAlfenNK,1995.AnewextracellularlaccaseofCryphonectriaparasiticaisrevealedbydeletionofLac1.MolPlant_MicrobeIn,8:259~266LeontievskyAA,MyasoedovaNM,BaskunovBP,EvansCS,GolovlevaLA,2000.Transformationof2,4,6_trichlorophenolby

thewhiterotfungiPanustigrinusandCoriolusversicolor.Biodegradation,11:331~340

LeontievskyAA,MyasoedovaNM,GolovlevaLA,SedaratiM,EvansCS,2002.Adaptationofthewhite_rotbasidiomycetePanus

tigrinusfortransformationofhighconcentrationsofchlorophenols.ApplMicrobiolBio,59:599~604

LewisNG,DavinLB,SarkanenS,1998.Ligninandlignanbiosynthesis:distinctionsandreconciliations.In:LewisNG,Sarka2

nenSeds.LigninandLignanBiosynthesis.Washington,DC:AmericanChemicalSociety,1~27

LiL,SteffensJC,2002.Overexpressionofpolyphenoloxidaseintransgenictomatoplantsresultsinenhancedbacterialdiseaseresis2

tance.Planta,215:239~247

LiuL,TewariRP,WilliamsonPR,1999a.LaccaseprotectsCryptococcusneoformansfromantifungalactivityofalveolar

macrophages.InfectImmun,67:6034~6039

LiuL,WakamatsuK,ItoS,WilliamsonPR,1999b.Catecholamineoxidativeproducts,butnotmelanin,areproducedbyCrypto2coccusneoformansduringneuropathogenesisinmice.InfectImmun,67:108~112MayerAM,StaplesRC,2002.Laccase:newfunctionsforanoldenzyme.Phytochemistry,60:551~565

NosanchukJD,RosasAL,LeeSC,CasadevallA,2000.MelanisationofCryptococcusneoformansinhumanbraintissue.Lancet,

355:2049~20504期王国栋等:漆酶的性质、功能、催化机理和应用 475

PezetR,PontV,Hoang_VanK,1992.EnzymaticdetoxificationofstilbenesbyBotrytiscinereaandinhibitionbygrapeberriesproan2

throcyanidins.In:VerhoeK,MalathrakisNE,WilliamsonBeds,RecentAdvancesinBotrytisResearch.Wageningen:PudocScientificPress,87~92

RanochaP,ChabannesM,ChamayouS,DanounS,JauneauA,BoudetAM,GoffnerD,2002.Laccasedown_regulationcausesal2

terationsinphenolicmetabolismandcellwallstructureinpoplar.PlantPhysiol,129:145~55

RodriguezE,PickardMA,VazquezDR,1999.Industrialdyedecolorizationbylaccasesfromligninolyticfungi.CurrMicrobiol,

38:27~32

SakuraiT,SuzukiS,1997.Spectroscopyofcucumberascorbateoxidaseandfungallaccase.In:MesserschmidtAed.Multi_copperOxidases.Singapore:WorldSciencitificPress,225~250

SterjiadesR,DeanJFD,ErikssonKE,1992.Laccasefromsycamoremaple(Acerpseudoplatanus)polymerizesmonolignols.Plant

Physiol,99:1162~1168

TheArabidopsisGenomeInitiative,2000.AnalysisofthegenomesequenceofthefloweringplantArabidopsisthaliana.Nature,408:

796~815

TorresJ,SvistunenkoD,KarlssonB,CooperCE,WilsonMT,2002.Fastreductionofacoppercenterinlaccasebynitricoxide

andformationofaperoxideintermediate.JAmChemSoc,124:963~967

TsutsumiY,HanedaT,NishidaT,2001.RemovalofestrogenicactivitiesofbisphenolAandnonylphenolbyoxidativeenzymesfrom

lignin_degradingbasidiomycetes.Chemosphere,42:271~276

WongY,YuJ,1999.Laccase_catalyzeddecolorizationofsyntheticdyes.WaterRes,33:3512~3520

YaropolovAI,SkorobogatøkoOV,VartanovSS,VarfolimeyevSD,1994.Laccase:properties,catalyticmechanism,andapplica2

bility.ApplBiochemBiotechn,49:257~280

ZhuX,GibbonsJ,ZhangS,WilliamsonPR,2003.Copper_mediatedreversalofdefectivelaccaseina$vph1avirulentmutantof

Cryptococcusneoformans.MolMicrobiol,47:1007~1014

ZoppellaroG,SakuraiT,HuangH,2001.AnovelmixedvalenceformofRhusverniciferalaccaseanditsreactionwithdioxygento

giveaperoxideintermediateboundtothetrinuclearcenter.JBiochem_Tokyo,129:9~653

陈晓亚,男,1955年8月出生,中国科学院上海植物生理生态研究所研究员,博士生导师。从事植物次生代谢和棉花分子生物学研究。王国栋,男,1973年出生,中

国科学院上海植物生理生态研究所博士生。