纯种柔嫩艾美耳球虫的分离培养

安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（２０）：５２７３，５２７５　责任编辑姜丽责任校对胡剑胜　纯种柔嫩艾美耳球虫的分离培养　张祝明　，曾明华　，李培英Ｉ，韩玲　，姚建国　（１．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥２３００３６；２．安徽农业大学理学院，安徽　合肥２３００３６）　摘要用琼脂滴稀释法，对４株柔嫩艾美耳球虫进行单卵囊分离，每株各感染５　１３龄罗曼公雏５只，结果感染成功率分别为６０％，４０％　２０％，２０％，总的成功率为３５％，能基本满足后续试验的需要。　关键词鸡；艾美耳球虫；分离　中图分类号￥８５８．３１　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００６）２０—５２７３—０１　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｏｏｃｙｓｔ　ｆ　ｏＥ．ｔｅｎｅｌｌａ　ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｕ－ｍｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ（Ａｎｉｍａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ　２３００３６）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　４　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉｎｇｌｅ　ｏｏｃｙｓｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ａｇａｒ－ｄｒｏｐ　ｍｅｔｈｏｄ．５　Ｌｏｈｍａｎｎ￣ｏｃｋｓ　ｗｉｔｈ　５　ｄａｙ－ａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｏｃｙｓｔ．Ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６０％．４０％．２０％ａｎｄ　２０％ａｎｄ　ｆｉｎａｌ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　３５％ｉｎ　ｔｏｔａ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｃｈｉｃｋｅｎ；Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　鸡球虫病是由艾美耳属的单细胞寄生虫引起的严重危　平，厚度均匀，约２．５　ｍｍ）。待琼脂板凝固后，用口径约３．５　ｍｍ害家禽生长发育的一种疾病。在各种鸡病中，球虫病发生率　最高，占１／６～１／５Ⅲ；集约化养鸡场是球虫病爆发的最适场　的吸管在琼脂板上均匀的打孔，再将孔内的琼脂滴轻　轻的转移到另一张载玻片上（每张片子以９个琼脂滴为　宜）。为防琼脂滴变干，可将制好的载玻片放在大平皿中，加　水加盖，置于４℃冰箱中备用。　所，其发病率为５０％～７０％，死亡率为２０％～３０％，严重时　高达８０％【２１。据报道，全世界每年因球虫病造成的经济损失　多达２０亿美元，抗球虫药的年消费为３．２亿美元　１。目前，　许多学者都在进行鸡球虫学的研究，以便能更好地控制或　消灭鸡球虫病。单卵囊分离扩增是鸡球虫学研究领域一项　基本的操作技术，鸡球虫的许多研究都必须在其基础上开　展，如虫种的鉴定，免疫学的研究，基因图谱，同工酶谱以及　耐药性的研究　等。单卵囊的分离扩增主要有稀释法和显　微操作法［８１。该试验采用的是改良稀释法。　１材料与方法　１．１材料　１．２．３单卵囊选择。取已孢子化的卵囊样少许于离心管中，　加入饱和食盐水，２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３　ｍｉｎ，将上层含卵囊的　液体移人事先洗净的青霉素小瓶中（用细铁丝环沾取），用生　理盐水稀释到合适的浓度（低倍显微镜下观察时，只有１～２　个卯囊）。用牙签沾取卵囊悬液于琼脂滴上，低倍显微镜仔　细观察，确实为单个卵囊的调至４０倍观察，确保卵囊孢子　化完全：同时观察其形态特征，并测量其大小，符合柔嫩艾　美耳球虫形态学特征的用厚约１．５　ｍｍ的琼脂片包好移入　胶囊中，做好标记备用，饲喂小鸡。　１．２．４雏鸡分组及单卵囊感染。选取２０羽５日龄粪检无球　虫感染的罗曼小公雏，随机分成４组，每组５羽。第１组接　种安庆株分离的单个卵囊，记组号为Ａ，并依次编号为Ａ．，　Ａ　，Ａ　，Ａ　，Ａ　；第２组接种巢湖株１分离的单个卵囊，记组号　为Ｂ，并依次编号为ｃ，，ｃ：，ｃ　，ｃ　，Ｃ　；第３组接种巢湖株Ⅱ　分离的单个卯囊，记组号为ｃ，并依次编号为Ｄ，，Ｄ：，Ｄ　，Ｄ　，　Ｄ　；第４组接种肥西株分离的单个卵囊，记组号为Ｆ，并依次　编号为Ｆ。，Ｆ　，Ｆ３，Ｆ４，Ｆ　。　１．１．１混合卵囊。取采自肥西、巢湖Ｉ、巢湖Ⅱ、安庆的病鸡　盲肠内容物，分离培养，主要含Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ。　１．１．２试验动物。购自安徽省畜禽品种改良站的罗曼雏　公鸡。　１．１．３仪器。恒温培养箱，冰箱，显微镜，离心机，电炉；天　平，１０ｍｌ移液管，三角烧瓶，血球计数板，载玻片，平皿等。　１．１．４试剂。琼脂粉，重铬酸钾（Ｋ　Ｃｒ２０　），饱和食盐水，蒸馏　水，生理盐水等。　１．２方法　将准备好的含单个卵囊的胶囊经口投服给雏鸡，然后　１．２．１卵囊准备。分离的病鸡盲肠内容物，混匀在２０倍体　积的浓度为２．５％的重铬酸钾溶液中，放入２７℃左右的恒　单个隔离饲养于严格消毒的笼舍中，饲料和饮水严格消毒，　感染后第５天起收集粪便镜检。检出有球虫的粪样，镜下观　察球虫形态、大小一致并与祖代吻合的，收集培养。感染后　第８天扑杀剖检所有鸡只的盲肠。　１．２．５继代增殖。用Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ　４株中孢子化卵囊的第１代　分别感染１２日龄无球虫雏鸡，收集感染后第６～８天的粪样　进行培养，再感染雏鸡，继代若干次，直至收集大量的纯种　卯囊，孢子化后保存备用。　２结果与分析　温培养箱中培养（培养的前１８　ｈ，每６　ｈ轻搅拌１次，以后每　天搅拌１～２次），至９５％的卵囊孢子化，置４℃冰箱中保存　备用。　１．２．２琼脂板和琼脂滴的制备。在三角烧瓶中，将琼脂粉按　照２％的比例加入蒸馏水中，于电炉上加热使其溶化，沸腾　后冷却至７０℃左右，然后用１０　ｍｌ的移液管取适量（４　ｍｌ左　右）均匀的加在载玻片上，制成琼脂板（注意保持琼脂面水　对所接种的卯囊进行了形状观察和大小的测量，其结　基金项目　安徽省教育厅自然科学项目（２００５ＫＪ０２５ＺＤ）。　张祝明（１９８０一）．男．安徽望江人．硕士研究生．研究方向　作者简介　果见表１：从表１可以看出，在经接种４株球虫的雏鸡中，Ａ　组检出有３羽感染成功，感染率为６０％；Ｃ组中感染成功的　（下转第５２７５页）　兽医驱虫药。＊通讯作者。　收稿日期　２ｏｏ６—０４－０５　维普资讯 http://www.cqvip.com

３４卷２Ｏ期　毅抗病毒病转基因烟草的研究进展　成修饰作用等。克服办法主要有改进遗传法，筛选单拷贝转　基因个体，加强启动子和增强子的，去甲基化试剂使用　和对转基因影响机理等方面进行深入研究等。　病毒组病毒的衣壳蛋白基因的转基因烟草，被另１种马铃　薯Ｙ病毒组病毒感染后，转基因作物上出现了２种病毒类　型，除正常的感染病毒外，还有一种是由转基因植物合成的　衣壳蛋白包装的病毒。另外病毒间的协同作用可能会使病　毒病变得更加严重。　３转基因技术在抗烟草病害上的应用前景　有的转基因抗病植株的抗病性不稳定。一方面，转入的　外源基因容易发生变异或使抗性丧失；另一方面，由于大量　抗病毒病转基因植株的种植，使病毒区系发生变化，从而使　次要病害上升为主要病害。如李月秋研究发现，经种植抗病　毒病转基因烟草，群体内病毒区系在种类上没有变化，但病　毒的组成发生了变化　，这可能引起次要的病毒病害上升为　目前，人们对转基因植物的安全性存在疑虑，并且转基　因技术本身还存在一些缺陷，但是，任何事物都有两面性，　随着生物技术的发展，转基因技术将会在植物抗病育种中　得到很好的应用。　参考文献　［１］ＰＯＷＥＬＬ　Ａ　Ｐ．Ｄｅｌａｙ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｓｅ，　１９８６（２３２）：７３８—７４３．　主要的病毒病害。　大量转基因抗病植株的种植可能会发生基因漂移。基　因漂移是指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散　的过程。转基因植物基因通过花粉向近缘非转基因植物转　移，使得近缘物种有获得优势抗病基因的潜在可能性，从而　使这些植物含有了抗病基因而成为“超级杂草”。　抗病毒转基因植物可能存在潜在的生态风险。病毒之　间的重组或相似核苷酸之间的交换可能导致新病毒产生。　ｆ２张振臣，２Ｊ李大伟．黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）运动蛋白基因介导的抗病性　『Ｊ１．植物学报，１９９９，４１（６）：５８５—５９０．　【３］唐嘉义，张泽．抗ＴＳｗｖ转基因烟草植株的初步研究『ＪＪ．植物病理学　报，２００２，３２（３）：２８５—２８６．　在抗病毒转基因植株中，会发生转入的病毒外壳蛋白（ＣＰ）　基因与感染病毒的相关基因之间重组核苷酸或异源外壳转　移，因此产生新的病毒。Ｃｈｅｎ和Ｆｒａｎｃｋｉ曾报道，用黄瓜花　叶病毒（ＣＭＶ）的衣壳蛋白包装烟草花叶病毒（ＴＭＶ）基因　ｆ４］郭兴启，韩宏岩，张杰道，等．转不可翻译ＰＶＹＮ　ＣＰ基因烟草的抗　病性分析ｌＪ１．实验生物学报，２００３，３６（３）：１７６—１８４．　【５］孙凤成．转基因介导的抗烟草花叶病毒新策略【ＪＪ＿植物病理学报，　１９９７，２７（１）：９２．　组，结果原先不能被昆虫传播的ＴＭＶ可以被昆虫传播，从　而引起烟草花叶病大发生。Ｊａｒｖｉｓ等报道，含１种马铃薯Ｙ　・［６］张同庆，郭芳阳．抗黄瓜花叶病转基因烟草ＮＣ８９抗病性鉴定【ＪＪ＿河　南农业科学，１９９７（２）：２２—２３．　［７］李月秋，张仲凯．转基因烟草在田间引起的病毒区系变化研究【ＪＪ＿云　南农业大学学报，１９９８，１３（１）：５９—６２．　－—。　－—＋＿－＋－＋－＋－—。　－＋－十一—。　－＋－＋－＋－＋－＋－—。　－＋一十－＋－＋－＋－—。　－—。　・　＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋－十一十－＋－＋－＋－＋－＋－＋－＋（上接第５２７３页）　感染成功，１５～３０日龄不易或不能感染成功。　有２羽，感染率为４０％；Ｄ组成功感染１羽，感染率为２０％；　该试验采用琼脂滴稀释法，选取５日龄的雏鸡作为试　Ｆ组成功感染１羽，感染率为２０％。　表１　单卵囊分离所选祖代的球虫的大小　Ｉ．ｚｍ　验动物，对４株Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ进行单个卵囊的分离，结果Ａ、ｃ、　ＤＦ　４株的感染成功率分别为６０％，４０％，２０％，２０％，已能　满足后续试验的需要。　、参考文献　【１】张龙现，蒋金书，刘群，等．毒害艾美耳球虫纯种卵囊收集鉴定及致　病性删定『Ｊ１＿中国兽医杂志，２００１，３７（９）：１２—１３．　［２］索勋，汪明，吴文学，等强效艾美耳牌鸡球虫苗Ｉ型的田间试验【Ｊ】　＿畜牧兽医学报，２００１，３２（３）：２６５—２６９．　［３】李佩国，李蕴玉，张香斋，等．阶段用药抗柔嫩艾美耳球虫的效力［Ｊ］．　河北技术师范学院学报，２００１，１５（４）：５－８．　马立农，陈杖榴．鸡球虫耐药性的产生及其延缓措施『ＪＪ＿湖北农学院　学报，１９９９，１９（２）：１７９—１８２．　［５］ＣＨＡＰＭＡＮ　Ｈ　Ｄ，ＳＨＩＲＬＥＹ　Ｍ　Ｗ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｉｅｌｄ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　Ｅｉｍｅｆｉａ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ　ｂｒｏｉｌｅｒ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｔｏ　ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ　ｄｒｕｇｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　３结论与讨论　单卵囊分离是球虫学研究领域一项基本操作技术，要　获得好的分离效果应具备３个基本条件：①供接种的卵囊　质量要高，孢子化效果要好；②要确保接种的球虫能顺利进　入鸡体，以完成其生活史；③感染鸡的合适日龄。　单卵囊感染成功率与分离方法，雏鸡日龄，卵囊的侵袭　力等因素有关。目前常用的分离方法有显微操作法和稀释　法。显微操作法能准确的选取单个孢子化效果较好的卵囊　来接种雏鸡，但该法对仪器和操作技术要求较高，关键是选　取的单个卵囊能否顺利喂给幼雏以完成球虫的生活周期。　对于稀释法，不同的学者选取的材料不同，但操作方法基本　相似。安键等以玻璃纸做材料对Ｅ．ｔｅｎｅ１１ａ进行了分离，结果　感染成功率为３８％，感染成功率不高的原因可能是玻璃纸　ｃｈｉｃｋｅｎ［Ｊ］．Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４（７３）：１　４０４—１　４０８．　［６】ＭＣＤＯＵＧＡＬＤ　Ｌ　Ｒ，ＦＵＬＬＥＲ　Ｌ，ＳＯＬＩＳ　Ｊ．Ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　９９　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｏｃｃｉｄｉａ　ｆｒｏｍ　ｂｒｏｉｌｅｒ　ｆａｒｍｓ【Ｊ】．Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ，１９８０，３０　（４）：６９０—６９４．　【７］ＳＴＡＬＬＢＡＵＭＥＩ　Ｍ，ＤＡＩＳＹ　Ｋ　Ｊ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｏｎｅｎｓｉｎ，ｎａｒａｓｉｎ，　ｓａｌｕｎｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｎｉｃａｒｂａｚｉｎ　ｏｆ　ｆｉｅｌｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｃｏｃｃｉｄｉａｎ［Ｊ］．　Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１９８８（１７）：７９３—８０１．　［８］索勋，李国清．鸡球虫病学［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，１９９８：　ｌ６６－ｌ６７．　影响了球虫脱囊　。陶建平等研究了雏鸡日龄对单个卵囊感　染成功率的影响，结果第１、７、１５和３０天雏鸡的感染成功　［９］安键，汪明，王黎霞，等．鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的建立　【ＪＪ－北京农学院学报，２００４，１９（１）：５－６．　ｆｌＯ］陶建平，符敖齐．单卵囊感染雏鸡日龄及某些生物学特性的研究　【ＪＪ＿江苏农学院学报，１９９７，１８（４）：７７—７８．　率分别为６３－３％、６０％、３．３３％和０［１０Ｉ，指出１～７日龄雏鸡易　科技论文写作规范——结果　利用图、表及文字进行合乎逻辑的分析。务求精练通顺。不需在文字上重复图或表中所具有的数据，只　需强调或阐述其重要发现及趋势。