流感/禽流感病毒标准操作规程（SOP）——
Real-time PCR引物探针制备
一、目的
Real-time PCR引物探针制备用于人禽流感病毒Real-time PCR实验检测，确保Real-time PCR检测结果的可靠性。
二、范围
适用于中国国家流感中心所有技术人员对疑似流感/禽流感病毒感染标本进行Real-time PCR检测。
三、程序
（一）引物探针合成：
六合通（大连宝生物）或同类公司合成，PAGE纯化。 （二）探针标记：
5’端标记FAM，3’端TAMRA修饰。 （三）引物探针配制
1．引物工作浓度（40μM） 配制方法：
（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。
（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。
（例如：合成引物2OD，9.5nmol，则加水量为10×9.5＝95μL。） （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。 2．探针工作浓度（10μM） 配制方法：
（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。
（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。
（3）将100μM的探针10倍稀释，此时浓度为10μM，可作为工作浓度。 3．引物探针保存 -20℃或-20℃以下。
注意：引物配制前，先将引物管短暂离心，以免引物丢失。
