ｕｓｔ ２０１５，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．４ ｔｏｒＢｉｏｌ＆Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｕｇ中国媒介生物学及控制杂志２Ｏ１５年８月第２６卷第４期 Ｃｈｉｎ ＪＶｅｃ——・３３３・ ・论著・ 蚊虫线粒体基因组ＤＮＡ提取方法 邹依霖，丁奕然，罗钱春，陈斌 重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所，重庆市动物生物学重点实验室，重庆４０１３３１ 摘要：目的优化和改进一套适用于蚊虫线粒体基因组ＤＮＡ的提取方法。方法从动物线粒体基因组ＤＮＡ提取 的一般方法、步骤和原理出发，主要采用改进的高盐沉淀法，并注意去除核ＤＮＡ的污染。用紫外分光光度计、琼脂 糖凝胶电泳和线粒体ＣＯ Ｉ基因ＰＣＲ扩增产物鉴定所提的线粒体基因组ＤＮＡ。结果改进后的方法适用于单只蚊 优化和改进的提取 虫，用凝胶电泳检测后发现无核ＤＮＡ与蛋白质污染。改进后的方法简便易行，经过多种蚊虫线粒体基因组提取的 实验表明，提取的蚊虫线粒体基因组ＤＮＡ质量高，能满足ＰＣＲ、克隆、测序分析等要求。结论方法简便易行，得到的蚊虫线粒体基因ｆｌ￣ＤＮＡ质量高，能满足相关分析要求。 关键词：蚊科；线粒体基因组；ＤＮＡ提取方法；差速离心 中图分类号：Ｑ９６６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３－４６９２（２０１５）０４—０３３３—０４ ＤＯＩ：１０．１ １８５３￣．ｉｓｓｎ．１００３．４６９２．２０１５．４．０００１ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ＺＯＵ Ｙｉ－ｉｆｎ，ＤＩＮＧ Ｙｉ・ｒａｎ，ＬＵＯ Ｑｉａｎ・ｃｈｕｎ，ＣＨＥＮ Ｂｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０１３３１，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮ Ｂｉｎ，Ｅｍａｉｈ ｂｉｎ．ｃｈｅｎ＠ｃｑｎｕ．ｅｄｕ．ａｎ Ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｐａｒ．Ｅｕ Ｓｃｈｏｌａｍ Ｐｒｏｇｒａｍ，ｔｈｅ Ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｎｏ．ＵＳＡ，１Ｒ０１Ａ１０９５１８４）， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ（Ｎｏ．１８２６８／Ｒ０），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｉｆｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．３１３７２２６５， ３１０７１９６８）。Ｋｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ（Ｎｏ．ＣＳＴＣ２０１２ＧＧ—ＹＹＪＳＢ８０００２）ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｏｆ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐ ｆｏｒ Ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅｓ（Ｎｏ．２０１３１０６３７００６） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｆｉｌａ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｆｉｌ ｇｅｎｏｍｅｓ，ａｎｄ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔａｈｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ—ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｓａｌｔ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｒｅｍｏｖｉｎｇ．Ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＣＯ Ｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｏ ｂｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｉｎ ｏｕｒ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｅｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｅａｓｙ ａｎｄ ｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｆｏｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓａｍｐｌｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｍｔＤＮＡ ｉｓ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｆｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ 线粒体是广泛存在于生物体内的一个细胞器， 其基因组（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ）在不同动物种内的 传学、系统发育与进化等多个方面广泛应用 ］。尤 其在节肢动物线粒体基因组的研究上，线粒体基因 组通常被认为是解决节肢动物系统发生关系的一个 有力工具。 大小不一致，但在基因组组成上却很保守，大部分动 物线粒体基因组包含３７个基因ｎ ］。线粒体ＤＮＡ具 有母系遗传、进化速度陕等特点，多年来其基因作为 常见的分子标记，在进化生物学、分子分类、种群遗 昆虫是地球上种类最多的生物类群，也是线粒 体基因组研究较多的类群，目前测得昆虫线粒体基 基金项目：“两江学者”计划专项经费；美国国立卫生研究院ＮＩＨ项目（１Ｒ０１Ａ１０９５１８４）；联合国ＩＡＥＡ项目（１８２６８／Ｒ０）；国家自然科学基金 （３１３７２２６５，３１０７１９６８）；重庆市科技攻关重点项目（ＣＳＴＣ２０１２ＧＧ—ＹＹＪＳＢ８０００２）；大学生创新创业训练计划国家级创新训练项目 （２０１３１０６３７００６） 作者简介：邹依霖，女，硕士研究生，从事昆虫分子生物学研究，Ｅｍａｉｈ ２６０２１４５５ｌ＠ｑｑ．ｃｏｎｒ 通讯作者：陈斌，Ｅｍａｉｈ ｂｉｎ．ｃｈｅｎ＠ｃｑｎｕ．ｅｄｕ．ｅｎ 网络出版时间：２０１５—０６—０１ １５：ｌ１ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｅｐｕｂ．ｅｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｎｓ／ｏｌｄｎａｖｉ／ｎＣＮＫＩＰｕｂ ｐｘ？ｎａｖｉｉｄ：５９＆ＢａｓｅＩＤ：ＺＭＳＫ＆ＮａｖｉＬｉｎｋ： ＿： ： ±里塑 生 堂垦 垄查 ！ 生 旦箜 鲞箜兰塑Ｃｈｉｎ ＪＶｅｃｔｏｒＢｉ。ｌ＆Ｃｏｎｔｍ１，Ａｕｇｕｓｔ ２０１５，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．４ 因组６９６种，其中双翅目昆虫９Ｏ种（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｎｃｂｉ． ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）。蚊科昆虫是最重要 的医学昆虫类群，传播疟疾、登革热、流行性乙型脑 炎（乙脑）等８１种传染病，其中疟疾、登革热和乙脑 仍是我国重要的传染病，近年疟疾在不少地方又有 暴发的趋势，我国每年约有９０万疟疾病例 。蚊媒 传染病的控制主要依赖于媒介蚊虫的控制，以线粒 体基因作为分子标记澄清媒介蚊虫的隐存种，研究 其系统发育关系及种群的遗传特征对于蚊虫控制具 有指导意义。自１９９０年四斑按蚊（Ａｎｏｐｈｅ ｑｕａｄｒｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）线粒体基因组测序以来 ］，蚊科已 有２３种线粒体基因组被测序（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ． ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）。 目前主要通过提取全基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩 增得到线粒体基因组，然而核基因组内线粒体插入 序列ｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ，Ｎｕｍｔｓ）的存在，干 扰了ｍｔＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，使用蚊虫全基因组进行扩 增时，往往会扩增出很多非特异性条带，从而干扰实 验进行ｎ 。在高通量测序技术已经普及的今天，如 何获取高纯度的ｍｔＤＮＡ来推动蚊科昆虫线粒体基 因组的研究非常重要。本研究报道改进的蚊虫线粒 体基因组ＤＮＡ提取方法和操作流程，为相关工作者 提供技术支持。 １材料与方法 １．１ 实验蚊虫 中华按蚊（Ａｎ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）为重庆师范 大学实验室种群；斯氏按蚊（Ａｎ．ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）和大劣按 蚊（Ａｎ．ｄｉｒｕｓ）为中国人民第三军医大学实验 室种群；三带喙库蚊（Ｃｕｌｅｘ ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）和淡色 库蚊（Ｃｘ．ｐｉｐｉｅｎｓｐａｌｌｅｎｓ）为中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所实验室种群。 １．２试剂 Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ：５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，７ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖， ２２０ ｍｍｏｌ／Ｌ己六醇，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．４；ＢｕｆｆｅｒＩＩ： １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，４０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ； ２０％ＳＤＳ；２０ ｍｇ／ｍｌ的蛋白酶Ｋ；５－３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶 液；异丙醇；７５％乙醇；ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ：１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｆｉｓ—ＨＣ１ 和ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０。使用前，Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ、异丙 醇冷储在４℃备用。 １－３线粒体ＤＮＡ的提取提取线粒体ＤＮＡ的一般 方法是将线粒体从细胞中首先分离出来，之后再裂 解线粒体，利用ＤＮＡ在盐溶液中溶解度的变化提取 ＤＮＡ，并用相应的有机溶剂进行抽提。本文参照 Ｔａｍｕｒａ和Ａｏｔｓｕｋａ… 的方法加以改进。具体操作步 骤如下。 （１）取蚊虫置于干净的１．５ ｍｌ离心管中，加入 Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ ３００ Ｉ，研碎匀浆后再加入１２００ ｌ的 Ｂｕｆｆｅｒ ｌ。 （２）在４℃条件下，将匀浆以５００ ｒ／ｍｉｎ（离心半 径１０ ｃｍ）离心１０ ｍｉｎ，取上清液置于另一干净的１．５ ｍｌ离心管，再次以８００ ｒ／ａｒｉｎ（离心半径１０ ｅｍ）离心 １０ｍｉｎ。 （３）取上清液置于另一干净的１．５ ｍｌ离心管， ４℃条件下１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ（离心半径１０ ｅｒａ）离心１０ ｍｉｎ． 所得沉淀即为线粒体。 （４）弃上清液，沉淀物中加入３３０ Ｉｘｌ ＢｕｆｆｅｒⅡ． １３ ｔｘｌ ＳＤＳ和６ ｘＩｌ蛋白酶Ｋ，６０℃过夜。 （５）加入２５０ Ｉｘｌ ＮａＣ１溶液，在４℃条件下， ５０００ ｒ／ｍｉｎ（离心半径１０ ｃｍ）离心１０ ａｒｉｎ，再取上清 液置于另一干净的１．５ ｍｌ离心管，加入４８０ ｘＩｌ异丙 醇，在４℃和１２ ０００×譬条件下离心１５ ｍｉｎ。 （６）去掉上清，用７５％的乙醇洗涤，风干。 （７）加入１０￣３０ Ｉｘｌ ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ溶解，低温保存 备用。 １．４ ｍｔＤＮＡ样品鉴定 ４值测定：将提取出的ＤＮＡ取２ ｌ，用Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００全波长紫外分光光度计进行ＤＮＡ的纯度 与浓度检测。 琼脂糖凝胶电泳分析：采用无桥水平电泳装 置。ＴＡＥ为缓冲液，凝胶浓度为０．７％，在室温下以 ９０ Ｖ恒压电泳３０ ｍｉｎ，溴化乙锭染色３ ｍｉｎ，放置紫 外成像系统中进行观察，检测其是否降解。 线粒体ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增：以提取的蚊虫ｍｔＤＮＡ 样品作为模板，测定线粒体ＤＮＡ的ＣＯ Ｉ基因片段。 引物由上海生物工程有限公司合成，Ｆ：５ 一ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＡＡ ＡＣＴ Ａ１Ｔｒ ＡＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ Ａ一３ ：Ｒ： ５ 一ＧＣＴ ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＴＴ ＣＣ一３ 。扩增 长度为１０５０ ｂｐ，扩增ＰＣＲ反应总体积为２５ Ｉｘｌ，ＰＣＲ扩 增的反应体系：模板ＤＮＡ ２ ｌ，正反引物（１Ｏ ｘＩｍｏｌ／Ｌ） 各１ Ｉｘｌ，再加入ＴａｑＭａｓｔｅｒｍｉｘ到２５ Ｉｘｌ。ＰＣＲ扩增条件： ９４℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性１ ｍｉｎ，５２℃退火４５ ｓ， ７２℃延伸１ ｒａｉｎ；３５个循环后，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ 产物用１％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并送往上海 生物工程有限公司测序。 ２结果 ２．１ Ａ值测定利用上述方法成功地提取到５种蚊 虫的线粒体基因组ＤＮＡ，每个种分别提取３只蚊虫， 但中华按蚊提取了３种不同保存方式的蚊虫。对提 取的ｍｔＤＮＡ检￣］Ａ２６０／Ａ２８０值以及浓度（表１），５种 蚊虫中新鲜材料和一８０℃保存的蚊虫Ａ２６０／Ａ２８０值 在１．７６￣１．９７，表明得到的ｍｔＤＮＡ纯度较高，干燥标 本和一２Ｏ℃无水乙醇浸泡１年的Ａ２６０／Ａ２８０值均＞ ：３３６二＿Ｉ—— 中国媒介生物学及控制杂志２ｏ１５年８月第２６卷第４期Ｃｈｉｎ ＪＶｅｃｔｏｒＢｉｏｌ＆Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｕｇｕｓｔ２０１５，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．４ 究［Ｍ］．北京：科学出版社，２００８：２８—３３． ［２］胡婧，刘念，黄原．节肢动物线粒体基因组研究进展与基因顺 序分析［Ｊ］．昆虫分类学报，２００６，２８（２）：１５３—１６０． ［３］Ｈｅｄｇｅｓ ＳＢ，ＫｕｍａｒＳ，ＴａｍｕｒａＫ，ｅｔａ１．Ｈｕｍａｎ ｏｒｉｇｉｎｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ 进行纯化，但对于ＰＣＲ和克隆仍然能顺利进行。若 对ｍｔＤＮＡ的纯度要求较高，就要进行纯化以去除 ＲＮＡ、蛋白质、脂类和离子等物质，先用Ｒｎａｓｅ（终浓 度为５０ Ｉｘｇ／ｍ１）３７℃，水浴１ ｈ，在酚：氯仿：异丙醇 （ｚ５：２４：１）抽提去除蛋白质得到纯净的线粒体 ＤＮＡ［ 。 ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ＪＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５ （５０４５）：７３７～７３９． １４ｊ Ｆｅｒｒｉｓ ＳＤ，Ｂｒｏｗｎ ＷＭ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＷＳ，ｅｔ １．Ｅｘｔａｅｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ３．３核ＤＮＡ污染的去除材料不新鲜或者反复冻 ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｏｆ ａｐｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８１，７８（１０）：６３１９—６３２３． 融，细胞和细胞核破裂，释放的核ＤＮＡ断裂成小片 段后无法在ＳＤＳ作用下与ＮａＣ１形成沉淀，所以得 ［５］ＩＪｉｕ ＧＨ，Ｃｈｅｎ Ｆ，Ｃｈｅｎ ＹＺ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ 到的线粒体ＤＮＡ有核ＤＮＡ污染。可以加人适量 的ＤＮａｓｅ Ｉ，通过利用一定浓度的ＤＮａｓｅ Ｉ的消 化，可以完全消除线粒体表面上有可能存在的核 ＤＮＡ干扰。但是ＤＮａｓｅ Ｉ会较大地减少线粒体 ＤＮＡ提取量ｎ 。 ３．４样品的选择蚊虫吸血后，由于血液中含ＤＮＡ 故会导致污染，所以尽量采用未吸血的蚊虫。若采 用吸血后的蚊虫进行实验，应该剪去腹部后进行研 磨提取。此外，一般正常动物线粒体寿命仅为ｌ周， 离体的线粒体在低温下（Ｏ～８℃）能保存３～７ ｄ的 活性，而常温下只有ｌ～２ ｈｎ ，为保证提取效果以及 后续实验效果，应选取新鲜的样品或者一８０℃的冷 冻样品。对于蚊虫体积较小的样品来说，一般采用 整只或者使用单雌饲养的多只蚊虫；对于其他体 积较大的昆虫来说则可以选取含线粒体较多的肌 肉组织。 ３．５影响ｍｔＤＮＡ质量的操作研磨过程中不可研 磨过度，否则导致细胞核破裂，核ＤＮＡ可能会断裂 成小片段，最终导致得到的ｍｔＤＮＡ核污染加重。但 是也不能研磨不足，研磨不足会导致线粒体不能完 全释放，得到的线粒体少，最终得到的ｍｔＤＮＡ量 少。对于蚊虫，采用手动研磨，研磨至无明显碎屑 的匀浆即可。此外，除了裂解和风干外其余操作 均在低温下进行，操作轻柔，以防止核ＤＮＡ和 ｍｔＤＮＡ断裂。 参考文献 ［１］尹文英，宋大祥，杨星科，等．六足动物（昆虫）系统发生的研 ｄｏｇ ｔｉｃｋ Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（Ａｃａｒｉ：Ｉｘｏｄｉｄａｅ）ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｉｎｔ ＪＢｉｏｌＳｃｉ，２０１３，９（４）：３６１—３６９． 【６］Ｌｉ Ｈ，Ｌｉｕ ＨＹ，Ｓｏｎｇ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｉｔｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄａｍｓｅｌ ｂｕｇｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｔｒｉｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｎａｂｉｄａｅ （Ｉｎｓｅｃｔａ：Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（９）：ｅ４５９２５． ［７］Ｚｈｏｎｇ ＤＢ，Ｌｏ Ｅ，Ｈｕ ＲＪ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ｃｏｕｎｔｙ，ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｉｍｐａｃｔ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８ （７）：ｅ６８５８６． ［８］Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｗｏｒｌｄ ｍａｌａｉｒａ ｒｅｐｏｒｔ ２０１３［Ｒ］． Ｇｅｎｅｖａ：ＷＨＯ，２０１３． ［９］Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＳＥ，Ｃｏｃｋｂｕｒｎ ＡＦ，Ｓｅａｗｒｉｇｈｔ ＪＡ．Ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｑｕａｄｒｉｍａｃｕｌａｔｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ａ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，１９９３， ３６（６）：１０５８—１０７３． ［１０］ Ｒｉｃｈｌｙ Ｅ，Ｌｅｉｓｔｅｒ Ｄ． ＮＵＭＴｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ］ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｔ，２００４，２１（６）：１０８１—１０８４． ［１ １］Ｔａｍｕｒａ Ｋ，Ａｏｔｓｕｋａ Ｔ．Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｂｙ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｔ，１９８８，２６（１１／１２）：８１５—８１９． ［１２］杨汉民．细胞生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９７： ６３—６５． ［１３］ 陈毓荃．生物化学研究技术［Ｍ］．北京：中国农业出版社， １９９５：９—２４． ［１４］陈品健．动物生物学［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１：３０—３２． ［１５］萧浪涛，王三根．植物生理学实验技术［Ｍ］．北京：中国农业出 版社，２００５：３１－３３． ［１６］ 郭荣昌．动物遗传学［Ｍ］．北京：经济科学出版社，１９９７： ３８０－３８２． 收稿日期：２０１５—０３—２４
