・４２４・ 分子诊断与治疗杂志２０１６年ｌ１月 第８卷第６期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖｏ１．８ Ｎｏ．６ ● 综 述・ ｐ５３基因突变检测方法的演进和趋势 张艳霞 杨学习 ［摘要］ｐ５３基因是肿瘤蛋白Ｐ５３（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ５３）的编码基因，在维持基因组稳定、细胞 周期和凋亡及抑制肿瘤血管生成中发挥着重要的作用。ｐ５３基因突变信息在肿瘤分子筛查诊断、预防、 药物疗法选择等方面具有重要的参考价值。本文分析了ｐ５３基因与Ｐ５３蛋白突变检测的重要性、突变检 测方法的发展概况，如传统的ＤＮＡ测序、性片段长度多态性（ｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒ— ｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）、单链构像多态性（ｓｉｎｇｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）等８类实验室常规基 因突变检测策略及酵母中分离的等位基因功能分析技术（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ，ＦＡ— ＳＡＹ），近年来新兴的技术包括生物传感器、芯片、高分辨率溶解曲线（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ，ＨＲＭ），及 下一代测序技术，以期较为全面地展示现今ｐ５３及Ｐ５３突变检测的整体情况，为ｐ５３或其他基因突变研 究者选择突变检测方法提供参考。 ［关键词］ｐ５３基因；突变检测；下一代测序 Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＺＨＡＮＧ Ｙａｎｘｉａ ．ＹＡＮＧ Ｘｕｅｘｉ （１．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｒｕｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ，５１０６６５；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａ— ｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ，５１０５１５） 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】ｐ５３ ｇｅｎｅ ｉｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５３一ｃｏｄｉｎｇ—ｇｅｎｅ．Ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５３ ｐｌａｙｓ ｉｍｐｏｒｔｎｔａ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ— ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ．ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｇｒｅａｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｈｏｉｃｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ｅｔｃ．Ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐ５３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ５３ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ ａｓ ８ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ），ｓｉｎｇｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ）ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ（ＦＡＳＡＹ），ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃｌｕｄ— ｉｎｇ ｂｉｏ—ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ，ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｉｓ ｒｅ— ｖｉｅｗ ｍａｙ ｈｅｌｐ ｒｅａｄｅｒｓ ｑｕｉｃｋｌｙ ｌｅａｒｎ ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ａｎｄ Ｐ５３ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎ— ｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅｆｕｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐ５３ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ． 【ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ】ｐ５３ ｇｅｎｅ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ １９９３年，Ｐ５３被《科学》（ｓｃｉｅｎｃｅ）杂志选为“年 度分子”，具有“基因组卫士”的称号。作为一重要 的转录因子，Ｐ５３蛋白具有发现并暂停带有损伤 ＤＮＡ的细胞、修复损伤ＤＮＡ或激活损伤细胞 基金项目：南方医科大学课外科研学术活动（２００９ｋｗ１０９） 的凋亡途径、细胞的正常和分化、防止肿 瘤发生的功能。然而，研究表明其突变几乎在所 有肿瘤中是最高的，超过５０％的恶性肿瘤存在ｐ５３ 突变ｎ 。ｐ５３基因（ｐ５３ ｇｅｎｅ）的高突变率，提示其 作者单位：１．广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州５１０６６５ ２．南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州５１０５１５ 通讯作者：杨学习，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｘｚｂ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ 分子诊断与治疗杂志２０１６年１１月 第８卷第６期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖｏ１．８ Ｎｏ．６ 在肿瘤的发生发展中发挥着关键性的作用，ｐ５３与 Ｐ５３的突变检测具有重要的临床和科研意义。本文 通过文献概述了ｐ５３基因与Ｐ５３蛋白突变检测的重 要性，并指出它在早期的肿瘤易感性评估及预防、癌 基因检测的技术水平，特别是高通量测序技术的 兴起，使ｐ５３基因突变检测再次受到行业的关注。 ｐ５３的检测特别是核酸层面上的分析，可以在早期 的肿瘤易感性评估 及预防 、癌症早期诊断 、 耐药机制及治疗方法的优化 中不可忽视的参考基因之一。 、预后判断ｎ 等 方面发挥出更加显著的作用，也是肿瘤精准医疗 症早期诊断、耐药机制及治疗方法的优化、预后判断 等方面起重要作用，是肿瘤精准医疗中不可忽视的参 考基因之一。其次，重点对ｐ５３突变检测相关方法的 发展历史和趋势进行阐述，并从传统方法、生物传感 器等新兴热点技术及下一代测序３个角度简要介绍， 特别是下一代测序的发展及其在ｐ５３基因突变研究 中的现状，帮助相关研究者了解ｐ５３与Ｐ５３突变检测 方法的整体情况，快速选择合适的检测方法。 １ ｐ５３基因及其突变检测的重要性 ｐ５３基因，编码Ｐ５３蛋白，自发现以来一直是 肿瘤分子生物学领域最为热门的基因之一。起 初，由于癌症病人体内ｐ５３基因经常发生突变导 致其蛋白功能改变，Ｐ５３蛋白被视为癌蛋白。随 后十多年的研究，使科学家们认识到Ｐ５３实际为 抑癌蛋白 。人类ｐ５３基因位于染色体１７ｐ１３。 区，全长约２０ Ｋｂ，由ｌ１个外显子和ｌ０个内含子 组成，因编码一种分子质量为５３ ＫＤａ的蛋白质而 得名。。 。Ｐ５３蛋白单体全长３９３个氨基酸残基，至 少包括３个功能：Ｎ端功能域、ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＤＢＤ）及Ｃ端功能域。不同物种 之间，ＤＮＡ结合域的氨基酸序列是进化的保守 序列，其编码区为５￣８外显子，能与特定的ＤＮＡ 序列结合，既是ｐ５３基因突变多发区域，也是Ｐ５３ 蛋白肿瘤抑制功能的关键区域。因而大多数ｐ５３ 突变的研究均集中于５－９号外显子。ｐ５３的ＤＢＤ 区每个氨基酸都可能发生点突变，但研究报道， Ｒ１７５、Ｇ２４５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、Ｒ２７３、Ｒ２８２ ６个位点的 突变在癌症中高频率出现，且与癌症的发生发展 紧密关联，被称为“热点突变”ｌ４ ］。 ｐ５３基因突变的类型繁多，主要包括基因片段 的缺失、插入缺陷，点突变引起的错义突变，及杂 合性缺失。由点突变引起的错义突变比例占总体 的８０％ 。不同的肿瘤中ｐ５３的突变频率、位点和 形式各具特色，其突变的种类、位置和性质主要取 决于组织来源和致癌物的性质。目前科学界对于 ｐ５３基因的研究主要关注其在癌症发生和发展方 向、癌症之间的分子联结及癌症临床治疗中的预 测价值。３０多年来，分子生物学的发展提高了ｐ５３ ２ ｐ５３基因突变检测方法发展概况 用于ｐ５３突变检测的方法日新月异，本文按技 术原理及时间先后综合分类，从传统方法，近年来 新兴的技术包括生物传感器、芯片、高分辨率溶解 曲线（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ，ＨＲＭ），及高通量测 序共３大角度进行阐述。 ２．１传统的检测方法 传统的检测方法按原理不同归类，有ＤＮＡ测 序、基于酶的性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）连锁分析技 术及其相关改良技术、单链构像多态性（ｓｉｎｇｌｅ． ｓ￣ａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）、高效 液相色谱法（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ— ｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）、变性梯度凝胶电泳法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）、变性梯度毛细 管电泳法（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏ— ｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＤＧＥ）、连接酶链反应（１ｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ— ｔｉｏｎ，ＬＣＲ）、免疫组织化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ＩＨＣ）等８类实验室常规基因突变检测策略及酵母 中分离的等位基因功能分析技术（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ，ＦＡＳＡＹ）［１５］ｏ 前期对几大癌症相关ｐ５３突变位点的文献研 究发现，不管是对ｐ５３突变位点或单核苷酸多态性 （ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）的筛查、微 卫星多态性位点及其分型分析、杂合性丢失等核 酸分析，还是对突变Ｐ５３蛋白的定性和定量研究， 大都使用了上述方法ｎ 。ＤＮＡ测序是ｐ５３突变 检测中最受信赖的检测方法，能直接准确地检出 序列中的突变位点及类型；但不适合大规模临床 样本的分子诊断。ＤＨＰＬＣ、ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ不 能直接检出序列中未知突变的准确位点和类型， 但能检出其发生的区域信息，缩减对大量样本ｐ５３ 基因序列分析的工作量，在ｐ５３已知突变检测及未 知突变的鉴定研究中占主导地位。免疫组织化学 法可直接、快速、廉价、灵敏地检测出ｐ５３基因的失 ・４２６・ 分子诊断与治疗杂志２０１６年ｌ１月 第８卷第６期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖｏ１．８ Ｎｏ．６ 活，但变性Ｐ５３的特异性抗体难得，受个体评价标 准、存储条件和特殊抗体等的影响容易出现假阴 性 ，灵敏度不如基因测序。如Ｔａｋａｍｉ等 在研 究弥漫型胶质瘤中ｐ５３基因突变和免疫组化的关 系时指出Ｐ５３免疫组化是中度敏感和高度特异的 ｐ５３基因突变的提示性标记。各传统方法在ｐ５３ 和Ｐ５３蛋白突变检测中的典例、突变类别、优缺点 如表ｌ。 表１传统ｐ５３突变检测方法简介表 Ｔａｂｌｅ ｌ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ２．２生物传感器、生物芯片、高分辨率溶解曲线 技术 生物传感器、生物芯片、高分辨率溶解曲线技 术都是近年来的热点技术。生物传感器便宜、一 次性、微型化、便携化，适用于大量临床样本ｐ５３突 变检测ｎ。ｔ。 。基因芯片比Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ等传统探 针技术简单、通量高、集成化、应用性强，相比直接 测序，突变点的检测数目更多、速度更快、准确性 更高。如Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司的ｐ５３基因芯片，适用于 肿瘤的早期诊断和易感性判断。高分辨率溶解曲 ２．３下一代测序的发展及其在ｐ５３基因突变研究 中的概况 下一代测序（ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ） 又称高通量测序（ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）或大 规模平行测序（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃ． ｉｎｇ，ＭＰＳＳ），是比基因芯片更高通量、更低成本的 研究方法。自２００５年Ｒｏｃｈｅ公司推出的第一台高 通量测序仪来，市场上主要有３大成熟的高通量平 台即Ｒｏｃｈｅ公司的ＧＳ ＦＬＸ测序系统，Ｉｌｌｕｍｉｎａ公 司的Ｓｏｌｅｘａ基因组分析仪和ＡＢＩ公司的ＳＯＬＩＤ 线分析技术是在实时荧光ＰＣＲ的基础上发展而来 测序仪。早期，３类平台存在通量太大、实验周期 长、成本高的问题，常应用于重大项目的大规模测 的，闭管操作，低污染，准确率高、通量高、经济、简 单方便，且不受ＤＮＡ突变位置或类型影响，后期 数据分析处理方法简单易懂，适用于基因分型、短 片段重复序列分析、序列匹配、突变扫描、ＲＮＡ编 辑及甲基化扫描等研究 ］。然而，基因芯片灵敏 序或基础研究领域，不适应医疗领域的临床诊断、 分子诊断。为满足中小实验室研究及医院检测的 需求，３大公司相继推出了低成本、低通量的测序 平台，如Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ的Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｐｒｏｔｏｎ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ的Ｍｉｓｅｑ及Ｒｏｃｈｅ的 度低、探针不稳定、仪器成本高，ＨＲＭ的灵敏度、 精确度及系统的稳定性也有待提高。 ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒｂ 。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ平台将半导体芯片技术 分子诊断与治疗杂志２０１６年ｌ１月 第８卷第６期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖｏ１．８ Ｎｏ．６ 与化学反应独特地结合起来，利用检测ＤＮＡ合成 时释放的氢离子造成电位差（ｐＨ改变）的原理进 变研究的方法。ｐ５３突变检测方法朝高灵敏度、高 行测序，能直接将序列信息转变成电信号，避免了 原３大高通量平台所需的复杂精密的光学拍照系 统，还有多种测序长度及芯片的通量大小可供选 精确度、实时、快速、经济、自动化、突变类型集成化 的趋势发展。因此，实际中应结合具体研究目的、 ｐ５３的突变类型和客观条件，合理、综合其中一种或 多种方法以快速准确地检出ｐ５３突变。下一代测 择。具有快速、准确、灵活、成本低、操作简单等优 势。Ｍｉｓｅｑ是Ｉｌｌｕｍｉｎａ的个人型测序系统，在单个 仪器上整合了扩增、测序及数据分析的功能，并配 备专门的样本制备试剂盒，大大缩减了人工操作 序具有高效、所需ＤＮＡ量少、可同步分析多个基 因、多种突变类别的独特优势，且随着组织微切割、 靶向捕获和肿瘤细胞捕获技术、等温扩增ＰＣＲ等精 准技术的出现，其费用高、周期长、错误率高、读长 和仪器运行的时间；还具有强大的数据处理功能， 可使用其内置软件进行拼接、比对等基本分析，也 能借助在线ＢａｓｅＳｐａｃｅ系统，利用其中专业的大型 数据分析软件，很大程度地解决了中小型客户在 数据分析和存储等方面的困难。ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ也是精 巧型测序仪，具有长读长的独特优势，适应医院及 中小实验室对特定基因进行长片端测序。此外， 更多的中等通量的测序平台正被研发出来。 下一代测序能检出肿瘤基因组内基因的点突 变、碱基替换、拷贝数改变和插入与缺失等，研究者 们纷纷将其用于肿瘤全基因组、转录组、全外显子 组等研究。但前期对国内外ｐ５３突变位点与癌症 相关性的文献研究过程中发现，目前国内单独使用 下一代测序检测ｐ５３的案例相对稀少，但个别案例 使用全外显子捕获测序法筛查了肝癌 和肺癌“。 突变位点，并以Ｓａｎｇｅｒ法或质谱法进行检验，指出 下一代测序技术在体细胞突变位点鉴定或筛查中 具有可行性。不同的是国外已经有大量ｐ５３突变 相关研究使用了通量测序，并与一代测序、ＦＡＳＡＹ、 核酸质谱 朝及免疫组化等传统技术做了对比实 验。由于肿瘤细胞异质性等原因，不同的案例对于 下一代测序在ｐ５３突变检测中的效果说法不一。 总体而言，基于个体的异质性，单独检测ｐ５３ 基因突变的参考价值是有限的，在肿瘤或其他疾 病与基因的相关性研究中，多数情况下同时检测 其他相关的参考基因和位点所得的综合信息更有 意义。虽然下一代测序的特异性和灵敏度还有待 提高，但其在突变比例高的已知样本检出率较高， 较其它方法通量高、快速、经济，有望成为精准医 疗时代中检测ｐ５３等基因突变的得力手段。 ３总结和展望 ｐ５３突变类别多、位点多，已有的检测方法各 有优缺，至今尚未出现一种能取代所有ｐ５３突 短等问题的逐步得到解决，已经成为精准医疗时代 中最引人瞩目、最得力的分子诊断技术。 参考文献 ｌｌ Ｊ Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｍ，Ｅｅｌｅｓ Ｒ，Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ＩＡＲＣ Ｐ５３ ｄａｔａｂａｓｅ：ｎｅｗ ｏｎｌｉｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍ— ｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｕｓｅｒｓ［Ｊ］．Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ，２００２，１９ （６）：６０７—６１４． １２ｊ Ｂｅｎ ＤＹ，Ｐｒｉｄｅａｕｘ ＶＲ，Ｃｈｏｗ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｂｙ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅ￣ｏｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｒｉｅｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９８８，３（２）： １７９－１８５． ［３］ Ｍｉｌｌｅｒ Ｃ，Ｍｏｈａｎｄａｓ Ｔ，Ｗｏｌｆ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｓｈｏｒｔ ａｒｍ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７ｌＪｊ．Ｎａ— ｔｕｒｅ，１９８６，３１９（６０５６）：７８３－７８４． ［４］ 李大虎，张令强，贺福初．突变体ｐ５３研究进展 ［Ｊ］．遗传，２００８，３０（６）：６９７－７０３． １ ５ Ｊ Ｍｕｌｌｅｒ ＰＡ，Ｖｏｕｓｄｅｎ ＫＨ．Ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｌ Ｊ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，２０１４，２５（３）：３０４－３１７． １６ｊ Ｗｕ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｃｈｕ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｒｏｎ ３ ｓｉｘｔｅｅｎ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｐ５３ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙ— ｓｉｓｌＪ Ｊ．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１３，８（４）：ｅ６１６６２． １７ｊ Ｂｈｏｗｍｉｋ Ａ，Ｄａｓ Ｓ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ Ａ，ｅｔ ａ１．ＭＤＭ２ ａｎｄ Ｐ５３ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｉｎｄｉａｎ Ｐｏｐｕｌａ— ｔｉｏｎ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ—Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅ—Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｉｎ— ｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｌＪ Ｊ．Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ，２０１５，１６ （１４）：５７６７—５７７２． ［８］ 李琪，肖贵华，程长浩，等．非小细胞肺癌ＢＡＬＦ 中ＲＡＲ一８基因甲基化与ｐ５３突变检测及相关性研 究［Ｊ］．重庆医学，２０１５，４４（２３）：３２０６—３２０９． １９ Ｊ Ｅｌｈａｇ Ｒ，Ｍａｚｚｉｏ ＥＡ，Ｓｏｌｉｍａｎ ＫＦ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｌｉｂ— ｉｎｉｎ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ￣ｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｅｔｏｐｏ— ｓｉｄｅ ｉｎ ｐ５３ ａｎｄ ＰＴＥＮ—ｍｕｔａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ ・４２８・ 分子诊断与治疗杂志２０１６年ｕ月 第８卷第６期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖｏ１．８ Ｎｏ．６ ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１５，３５（３）：１２６３—１２６９． ［１０］ 代晓丽，刘静，罗瑛，等．靶向作用ｐ５３药物的研究 进展［Ｊ］．中国药理学通报，２０１４，３０（７）：９１２—９１６． ［１１］ Ｍａｌｃｉｋｏｖａ Ｊ，Ｐａｖｌｏｖａ Ｓ，Ｋｏｚｕｂｉｋ ＫＳ，ｅｔ ａ１．Ｐ５３ ｍｕｔａ— ｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｌＪｊ．Ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ，２０１４，３５ （６）：６６３－６７１． ［１２］ Ｕ３ｉ Ｋ，Ｎａｏｉ Ｙ，Ｋａｇａｒａ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ Ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ“ｄｅｅｐ”ｓｅ— ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌ Ｊ Ｉ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１４，３４２（１）：１９— ２６． ［１３］ Ｂａｌｌｙ Ｃ，Ａｄ￥ｓ Ｌ，Ｒｅｎｎｅｖｉｌｌｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｙｅｌＯｄｙｓｐ１ａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ ｌＪｊ． ＬｅｕｋＲｅｓ，２０１４，３８（７）：７５１－７５５． ［１４］ Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｔ，Ｋｕｃｈｉｂａ Ａ，Ｌｉａｏ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｔｕｍｏｒ Ｐ５３ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ，ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｌＪ Ｊ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１３１（５）： ｌ１６９－１１７８． ［１５］ 江铁山．几个与癌症相关基因（ＡＰ－２１３，Ｐ５３， ＮＯＤ２）的研究［Ｄ］．长沙：湖南师范大学，２００５． ［１６］ 铁剑，解云涛，徐晔，等．ｐ５３基因ｃｏｄｏｎ ７２多态性 与乳腺癌术后放化疗疗效相关性分析［Ｊ］．中国肿瘤 临床，２０１５，４２（３）：１５２－１５６． ［１７］ 张海勇，危晓莉，王玲玲，等．结直肠腺癌中神经内 分泌细胞微卫星改变和ｐ５３基因突变的检测［Ｊｊ＿中 华病理学杂志，２０１３，４２（１）：１０－１４． ［１８］ Ａｌｔｉｎｔａｓ Ｚ．Ｔｏｔｈｉｌｌ Ｉ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ Ｊ．Ｓｅｎｓｏｒｓ＆Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，２０１３，１８８（１８８）：９８８－９９８． ［１９］ 张萌．毛细管电泳在癌症诊断中的应用研究［Ｊｊ．职 业技术，２０１５，１４（１２）：８８－８９． ［２０］ Ｗａｔａｎａｂｅ Ｇ，Ｉｓｈｉｄａ Ｔ，Ｆｕｒｕｔａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍ— ｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ＰＬＫ１，ｐ２１，ａｎｄ ｐ５３ ｆｏｒ ｐｒｅ— ｄｉｃｔｉｎｇ ＴＰ５３ ｓｔａｔｕｓ：ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊｊ．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ，２０１５，３９（８）： １０２６－１０３４． ［２１］ Ｔａｋａｍｉ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ Ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－－ａ ｃｏｍｐａｒａ— ｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ １５７ ｄｉｆｆｕｓｅ ｇｌｉｏｍａｓ［Ｊｊ．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， ２０１５，２５（３）：２５６－２６５． ［２２］ Ｍａｌｃｉｋｏｖａ Ｊ，Ｓｔａｎｏ—Ｋｏｚｕｂｉｋ Ｋ，Ｔｉｃｈｙ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｄｅ— ｔａｉｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｙ—ｄｒｉｖｅｎ ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｌ Ｊ Ｊ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９（４）：８７７—８８５． ［２３］ Ｋｉｍ ＨＷ，Ｌｅｅ ＨＭ，Ｈｗａｎｇ ＳＨ，ｅｔ ａ１．Ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｂｉｏ— ｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１７（１）：１— ７． ［２４］杜明，丰有吉．ＤＨＰＬＣ和ＤＤＦ检测散发性卵巢癌 ｐ５３基因突变的应用［Ｊ］．中国临床医学，２００６，１３ （１）：１０８－１１１． ［２５］金明娟，张勇晶，张爽爽，等．Ｐ５３基因多态性与结 直肠癌易感性的关联研究［ｃ ３／／全国肿瘤流行病学肿 瘤病因学学术会议论文集，２００７． ［２６］俞星，金昱．延边地区Ｐ５３基因－７２密码子多态性与 宫颈癌预后的相关性［Ｊ］．延边大学医学学报，２０１５ （４）：２５２－２５４． １２７ｊ Ｓｏｒｌｉｅ Ｔ，Ｊｏｈｎｓｅｎ Ｈ，Ｖｕ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＴＰ５３ ｇｅｎｅ ｂｙ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏ— ｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＴＴＧＥ）［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１４， ｌ１０５：３１５－３２４． １ ２８ ｊ Ｌｉａｎ ＤＳ，Ｚｈａｏ ＳＪ．Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｄｉ— ａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｌＪｊ．Ａｎａｌｙｓｔ，２０１４，１３９（１４）： ３４９２－３５０６． １２９ Ｊ Ｓｕｎ Ｙ，Ｌｕ Ｘ，Ｓｕ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉ— ｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕ— ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏ— ｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌＪ ｊ．Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１５， ７４：７０５－７１０． ［３０］陈斌，雷秀霞，周小棉．高分辨率熔解曲线技术及其 在分子诊断中的应用进展［Ｊ］．分子诊断与治疗杂 志，２００９，ｌ（２）：１２０—１２４． １３１ｊ ｌｉｌｌｅ ＭＡ，Ｆａｓｓｕｎｋｅ Ｊ，Ｋ６ｎｉｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ． Ｖ６００Ｅ ａｎｄ ｎｏｎ—Ｐ．Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊｊ．ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１４（１）：１． ［３２］李明辉，杨振兴，侯睿，等．下一代测序技术在临床 检测中的应用［Ｊ］．生物产业技术，２０１３，６：１８． ［３３］代继红．原发性肝癌基因突变谱的鉴定及分化相关 基因表达特征的分析［Ｄ］．上海：华东理Ｔ大学， ２０１３． ［３４］胡桂林．肺癌组织内不同肿瘤细胞群体异质性与基 因组变异［Ｄ］．北京：中国科学院北京基因组研究所， 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