四 简答题（5分/题）
一P1噬菌体由哪些部分组成？P82 1 复制元件
2环化和包装信号 3 标记基因 4 克隆位点 5 填充片段
二 实现体外随机诱变的方法有哪些？P168 1 错误掺入法 2 增变菌株诱变 3 盒式诱变 4 化学诱变
三 构建基因文库的基本程序包括?P188
1 提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRAN并反转录成cDNA。
2 DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA。 3 重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌。 4 阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 四 抗性基因工程包括哪些内容？P243 1 抗虫基因工程。 2 抗除草剂基因工程。 3 抗病基因工程。 4 抗逆基因工程。
五 生物芯片的分类有哪些？P120
1 按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。
2 按点样方式不同，可分为原位合成芯片、微距阵芯片和电定位芯片。
3 按芯片固定的生物分子类型可将芯片分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室。 4 按芯片使用功能和用途不同可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片。 六 酶切反应条件的类型有哪些？P24 1 缓冲液 2 反应温度 3 反应时间
4 终止酶切的方法
七、试述PCR反应的步骤以及反应体系。P133
反应步骤：（1） 模板DNA变性，由双链状态变成单链状态。
（2） 引物与模板结合，完成复性过程。
（3） DNA聚合酶和底物合成与模板互补的DAN。
反应体系：（1） 缓冲液 （2） 脱氧三磷酸核苷 （3） 引物 （4） 模板
1
（5） DNA聚合酶
八 基因组DNA文库的构建程序？ (1）载体的制备。
(2) 高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取。 (3) HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离。
(4) 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞。 (5) 重组克隆的挑取和保存。 P190 九 PCR的扩增步骤?
首先将模版DNA进行变性，使双链DNA在高温下成单链，然后退火，使引物于模版的互补链结合，最后，在一定条件下，将DNA聚合酶dNTP连续加到引物的3′羟基端，合成DNA，这个步骤称为延伸。P134
十 动物基因工程载体必须具备哪些功能？P252 （1） 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。
（2） 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力。 （3） 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力 十一 分子克隆载体应具备哪些特点？P39 1 在宿主细胞内必须能够自主复制
2 必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制 3 有一定的选择标记，用于筛选
4 具有较高的拷贝数，便于载体的制备
十二 T—DNA转移的影响因素有哪些？P238 1 农杆菌菌株。
2 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期。 3 基因活化的诱导物。
4 外植体的类型和生理状态。 5 外植体的与培养。
6 外植体的接种及共培养。
十三 原生质体介导常用方法有哪些？P231 （1） PEG介导的基因转化。 （2） 脂质体介导基因转化。 （3） 电激法介导基因转化。 （4）显微注射介导的基因转化。
十四 构建cDNA文库时需要用到哪些工具酶？
答：逆转录酶，DNA 聚合酶 I 或 Klenow 片断，单链核酸酶 S1，末端转移酶，性
核酸内切酶，DNA连接酶
十五. 简述进行菌落原位杂交的基本过程。
答：噬菌斑杂交法的基本步骤是将重组噬菌体感染的宿主菌倒在平皿上，待生成噬菌斑后，将与培养皿一样大小的纤维素薄膜盖在上面，每个噬菌斑中约100000个噬菌体就影印转移到膜上。 膜揭下后，用碱处理除去蛋白质外壳，使噬菌体DNA变性并同膜共价结合，然后用同位素标记的探针与之杂交，放射自显影检测。按照膜与培养基上预先做好的方法标记，将阳性噬菌斑挑出来扩增。
十六. 基因芯片的主要应用是什么？
答：1 寻找正常样本与异常样本之间在mRNA表达水平差异的基因(定量和定性);
2
2 寻找和研究参与某一特定功能的基因或基因群; 3 确定目的基因表达的时空性; 4 测序与点突变的确定。
十七 .基因转移的病毒需要具备哪些基本条件？Ｐ２５４
１.携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2.介导外源基因转移与表达；3.对机体不致病。 十八 基因表达水平检测的方法？P268 1 报告基因。 2 Northern杂交。 3 反转录PCR。
4 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 5 Western杂交。
6 目的蛋白的生物活性检测。
十九 cDNA文库的构建步骤？P193 1 细胞总RNA的提取和mRNA分离。 2 第一链cDNA合成。 3 第二链cDNA合成。
4 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。 二十． 典型的DNA重组实验通常包含几步？ ①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。
②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 ③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。
④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。 二十一 荧光标记的方式？
1 .SYBR荧光染料 2.水解探针 3.发夹型杂交探针 P152 二十二 cDNA第二条链的合成方法
1.自身引导合成法 2.置换合成法 3.引导合成法 4.引物—衔接头合成法 二十三 噬菌体的特征？
双链DNA稳定，有高产，具有常规质粒的特征免除了将外援DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体这一既繁琐又费时的。P67 二十四 外源基因表达的方式有哪些？ 1 外源基因以融合蛋白形式表达。
2 构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中。 3 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达。 4 外源基因在细胞表面的表达。
二十五、PCR反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？
PCR反应体系所要求的条件: a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物（约20个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。c、dNTP。d、作为模板的目的DNA序列，E 无菌水，F，缓冲液
PCR反应体系的基本反应过程：预变性、变性、退火、延伸、复延伸。 二十六、性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？
⑪酶的纯度。
⑫DNA样品的纯度。 ⑬DNA的甲基化程度。
3
⑭酶切反应的温度与时间。 ⑮DNA分子的构型。
⑯性核酸内切酶的反应缓冲液。
二十七、作为基因工程载体必须具备的基本条件是什么 ①能在宿主细胞内进行和稳定的自我复制 ②具有合适的内切酶位点 ③具有合适的选择标记基因 二十八.分子克隆载体应具备的特征（P39） 答：（1）在宿主细胞内必须能够自主复制；
（2）必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制； （3）有一定的选择标记用于筛选； （4）有较高的拷贝数，便于载体的制备。 二十九.试述转基因动物的鉴定方法（P266） 答：主要有两种：标记筛选法和分子检测法
标记筛选法包括：（1）正负选择标记筛选法； （2）无启动子筛选法。
分子鉴定法包括：（1）PCR扩增； （2）斑点杂交； （3）Southern杂交； （4）荧光原位杂交。
三十.动物基因工程表达水平检测的报告基因应具备的特点（P268） 答：（1）报告分子不存在于宿主中或易于与内源性基因相区别； （2）应该有一个简单、快捷、灵敏及经济的分析方法；
（3）报告基因的分析结果应具有很强的线性范围，便于分析启动子活性的大小变
化；
（4）报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物体生理活动。 三十一 基因芯片的应用有哪些？P129 1 基因表达分析
2 基因型及多态性分析
4
3杂交测序
4核酸和蛋白质相互作用的研究 5疾病的诊断与治疗 6药物开发
7在营养与食品卫生领域的应用 8在环境科学领域中的应用 三十二、S1核酸酶的基本特性
①降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 ②Zn2+必需
③最适pH范围为4.0 - 4.3 ④需要NaCl 10 - 300 mM
⑤降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 三十三、T4-DNA酶的基本特性：
①5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性 ②在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切
③在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 ④在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 三十四、营养缺陷型筛选法的基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 三十五 基因芯片的特点
①微型化和自动化。现已出现的芯片面积最大不过525cm２,最小仅有1cm２,;每个阵列中阵点样品DNA的用量仅为5nl(0.5μg/μL)左右;同时杂交和洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。 ②高度平行性。基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验结果具有可比性.
③巨大的信息产出率。在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、时间与空间上的差异及遗传信息。 ④高度敏感性和专一性。能可靠并准确检测出10 pg/μL的DNA样品。
⑤高度重复性。一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。
⑥强大的类比性。使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成。 ⑦哺育新的实验方法。此技术易与其它常规生物技术相融合交叉。基因芯片这些独一无二的特点也代表了后基因组时代技术的发展方向。
三十六、在进行PCR时，遇到凝胶电泳中出现引物二聚体区带问题时应怎样解决？ ①检查引物的 3’端是否互补； ②设计较长的引物；
③增加靶目标DNA的量； ④降低引物浓度； ⑤减少周期次数； ③增加退火温度； 五 问答题（10分/题）
一 酵母基因工程有哪些优点？P274
答：酵母基因工程的优点具体表现在以下方面：
5
① 酵母是真核生物，大多具有较高的安全性。
② 酵母繁殖速度快，能够像细菌一样在廉价的培养基上高密度培养，因此能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。
③ 将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转译后修饰能力相结合，能方便地用于外源基因的操作。
④ 采用高表达的启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导。
⑤ 作为真核生物，提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物与天然蛋白一样或类似。 ⑥ 酵母菌可将表达的外源蛋白与N—末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。
⑦不会形成不溶性的重组蛋白包涵体，易于进行分离提纯。
⑧ 酵母还能像高等真核生物一样移去起始甲硫氨酸，这避免了在作为是使用中引起免疫反应的问题。
⑨酵母菌的分子生物学研究已取得重大进展，已完成全基因组测序，它具有比大肠杆菌更完备的基因表达机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。
⑩ 酵母可进行蛋白的N—乙酰化、C—甲基化、十四酰化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要作用。
二、简述影响转化率的因素。
⑪载体本身的性质：①载体及DNA重组分子方面，不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同； ②载体的空间构象，质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级； ③插入片段的大小，对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 。
⑫受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高
⑬转化方法方面： ①受体细胞的预处理，影响最大；②供受体的比例；③转化方法。 三、PCR引物的设计一般原则
①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 ②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
③G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 四 如何有效地提高外源基因的表达效率？
⑪提高启动子强度 ⑫缩短启动子同克隆基因间距离 ⑬高效的翻译起始序列 ⑭高效的转录终止区 ⑮提高质粒拷贝数及稳定性 ⑯用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的 ⑰减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制 ⑱提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质
五 与标准PCR反应条件相比，针对TaqDNA聚合酶固有的突变序列亲向性和突变率，易错PCR常采用哪些方法改变碱基的错误掺入率，以及向提高G+C含量或A+T含量的方向诱变？
1、增加MgCl2,浓度到7mmol/L，稳定非互补的碱基配对。
2、加入0.5mmol/LMnCl2,锰离子能降低聚合酶对模板的特异性。 3、增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应。
4、限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1%~10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合
6
酶经短暂停顿后，会插入另外3中可用核苷酸的一种。
5、3种为正常浓度的正常碱基，第4种碱基为次黄嘌呤dITP。次黄嘌呤在缺少正确配对的碱基位置掺入DNA链，在下一轮扩增中，次黄嘌呤能与胞嘧啶、胸腺嘧啶和腺嘧啶配对。 6、增加dCTP和dTTP的浓度到1mmol/L,促进错误掺入。
7、使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。Mutazyme的突变倾向性与TaqDNA聚合酶相反，倾向于GC碱基对突变为AT碱基对。
六 大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍？
答： 特点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。 存在的障碍：第一，在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及16S核糖体RNA 3′末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。
第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。
第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。
七 PCR技术主要应用于哪些领域？
①核酸基础研究②序列分析③检测基因表达④从cDNA文库中放大特定序列⑤研究已知片段邻近基因或未知DNA片段⑥进化分析⑦医学应用⑧分析生物学证据⑨性别控制⑩转基因检测。
八. 肿瘤的产生可能是抑癌基因突变或表达失误造成，也可能是原癌基因突变或表达失误造成。对肿瘤患者进行基因治疗时，应该采取哪些策略？ 答：）增强机体对肿瘤细胞的免疫能力
2）植入敏感或自杀基因到肿瘤细胞。所谓自杀基因治疗，就是将某些细菌、病毒和真菌 中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒 或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的 3）阻断癌基因的表达，主要用反义RNA法，RNA干涉技术，核酶技术等，如Myc基因的 反义RNA片段。
4）应用肿瘤抑制基因如p53。人类恶性肿瘤中 p53基因突变率较高，用野生型的p53基 因治疗肿瘤在模型动物上取得了显著的成功。 5）诱导正常组织产生抗肿瘤物质
6）保护正常组织免受化疗的影响――耐药基因治疗。多药耐受MDR是指肿瘤细胞接触某 一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其他结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。耐药 基因治疗是指将一些耐药基因转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样 就可以用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。
7）抑制肿瘤血管生成。肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物 质，没有血管的生成，肿瘤最大也只能长至1－2mm 。通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿 瘤的生长，防止肿瘤的转移。VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中的一个重要的调节因子， 它可选择性刺激内皮细胞，并能增加微血管的通透性。通过阻断VEGF的翻译和转录 过程可使它的产生受到抑制。如引入反义VEGF的cDNA基因，通过与VEGF的mRNA结合来抑制VEGF蛋白的翻译。
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