胰升血糖素样肽-1受体激动剂高通量筛选细胞模型研究

维普资讯 http://www.cqvip.com 第４６卷２００７年第５期　９月　中山大学学报（自然科学版）　ＡＣＴＡ　ＳＣＩＥＮＴＩＡＲＵＭ　ＮＡＴＵＲＡＬＩＵＭ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳ　ＳＵＮＹＡＴＳＥＮＩ　Ｖｏ１．４６　Ｎｏ．５　Ｓｅｐ．　２００７　胰升血糖素样肽一１受体激动剂　高通量筛选细胞模型研究　范益军　，欧阳克清　，王贵学　，罗傲雪　（１．重庆大学生物工程学院，重庆４０００４４；　２．四川农业大学资源与环境系，四川都江堰６１１８３０）　摘　要：为建立ＧＬＰ一１受体激动剂的高通量筛选方法，将ＧＬＰ一１受体质粒和报告基因质粒（３　ｘ　ＣＲＥ／３×ＭＲＥ／　ＳＲＥ—ＬＵＣ／ｐＧＬ３）按照１：５的比例共转染到ＣＨＯ细胞中，建立ＧＬＰ一１受体激动剂筛选细胞株。利用ＧＬＰ．１内源　激动剂探索和优化每孔细胞接种密度、荧光素酶表达时间、Ｂｒｉｇｈｔ．ＧｌｏＴＭ试剂用量、ＤＭＳＯ浓度等筛选条件，建立　可靠的筛选方法。当细胞数目为４×１０　个／４Ｌ，激动剂孵育时间为８　ｈ，Ｂｒｉｇｈｔ—Ｇｌｏ　试剂４倍稀释，每孔ＤＭＳＯ　终质量分数小于１％时，系统ｚ　一因子为０．７５。利用此模型对中药提取物库进行检测，发现有５个样品显示出活　性。结果表明，该模型能够用于ＧＬＰ一１受体激动剂的高通量筛选。　关键词：胰升血糖素样肽一１受体；２型糖尿病；高通量筛选；报告基因　中图分类号：Ｒ５８７．１　文献标识码：Ａ　文章编号：０５２９－６５７９（２００７）０５－００８３－０５　量筛选模型，利用其内源性激动剂ＧＬＰ．１对筛选　胰升血糖素样肽一１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ—Ｌｉｋｅ　Ｐｅｔｉｄｅ一１，　ＧＬＰ．１）是一种前胰升血糖素（Ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）衍生　出来的多肽激素，能使正常人口服或静脉注射葡萄　糖后增加胰岛素的分泌，因此也被称为肠促胰岛素　（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）；ＧＬＰ一１受体属于Ｇ蛋白偶联受体中的　Ｇｓ受体，是一种选择性和组织特异性蛋白质。　条件进行了摸索和优化，建立了可靠的筛选方法。　ｌ材料与方法　１．１药品与试剂　转染试剂ＣｙｔｏＰｕｒｅ　购自Ｎｉｔｔｏ　Ｄｅｎｋｏ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ＧＬＰ．１通过激发其受体（ＧＬＰ．１　Ｒ）产生生理功能，　能明显刺激胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性、抑制　胰升血糖素水平和减慢胃的排空，对２型糖尿病和　１型糖尿病均有效，而且将其用于治疗不会产生低　血糖…。因此，研究其受体的小分子化合物激动　剂，是２型糖尿病治疗的一种新途径。　高通量药物筛选技术（ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎ—　ｉｎｇ，ＨＴＳ）是近年发展起来的一项新的药物发现技　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。Ｂｒｉｇｈｔ．Ｇｌｏ　荧光试剂、ｐＧＬ３载体、　Ｈｕｍａｎ　ｃＤＮＡ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。Ｇ４１８购自Ｇｉｂ—　ＣＯ　公司。ＧＬＰ．１购自Ｓｉｇｍａ公司。ｐＣＤＮＡ３．１载　体购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。细胞培养材料购自Ｂｉｏ．　ｃｌｏｎｅＴＭ公司。ＤＭＳＯ等化学试剂购于成都科龙化工　试剂厂。　１．２　实验仪器　术，它结合自动化操作系统和微量灵敏的生物反应　及检测系统，利用分子或细胞水平的药物筛选模型　来评价化合物的生物活性，其筛选速度快、规模　大、消耗量小，能实现一药多筛　。　多功能酶标仪ＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ），Ｂｉｏｎｐｈｏｔｏｍ．　ｅｔｅｒ（Ｅｎｐｐｅｎｄｏｒｆ），ＰＣＲ仪（ＰＥ公司），超纯水系　统（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ），９６孔分析板（Ｃｏｍｉｎｇ　Ｃｏａｔａｒ）。　１．３质粒构建　Ｇ蛋白偶联受体是高通量药物筛选的重要药　靶，在对其激动剂和拮抗剂的高通量药物筛选中，　引入基于基因重组技术的报告基因筛选方法，将第　二信使的变化与报告基因相偶联，通过报告基因的　表达量，反映第二信使的变化与配体的功能，能极　大的提高筛选通量，高效而且节省成本。　本实验建立了一个ＧＬＰ一１受体激动剂的高通　｝收稿日期：２００６—０９—０１　报告基因质粒（３×ＣＲＥ／３×ＭＲＥ／ＳＲＥ—ＬＵＣ／　ｐＧＬ３）的构建：将ｃＡＭＰ响应元件ＣＲＥ、多重响　应元件ＭＲＥ和血清响应元件ＳＲＥ插入到含荧光素　酶基因（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ，ＬＵＣ）的ｐＧＬ３载体上，　从而构建了报告基因质粒３×ＣＲＥ／３×ＭＲＥ／ＳＲＥ—　ＬＵＣ／ｐＧＬ３　。　基金项目：国家９７３计划资助项目（２００３ＣＢ７１６６０１）　作者简介：范益军（１９８０年生），男，讲师；通讯联系人：欧阳克清；Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｉｎｇｋｅ２０１＠１２６．ｃｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com 中山大学学报（自然科学版）　第４６卷　ＧＬＰ一１受体质粒的构建：根据ＧＬＰ一１受体基因　序列设计引物，以Ｈｕｍａｎ　ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ　扩增，将扩增产物克隆到ｐＣＲ２．１载体，再亚克隆　到ｐＣＤＮＡ３．１载体，得到ＧＬＰ一１受体质粒（ＧＬＰ一　１Ｒ／ｐＣＤＮＡ３．１），测序。　１．４稳定细胞株的建立　将ＣＨＯ细胞消化，接种于６孔板中，接种密　度为０．８　Ｘ　１０。一１　Ｘ　１０。个／ｍＬ，ＲＰＭＩ１６４０完全培　养基（ＲＰＭＩ１６４０基本培养基、　＝１０％胎牛血清、　＝１％非必需氨基酸，　＝１％青霉素＋链霉素），　置３７℃、　＝５％ＣＯ２孵箱中培养。　待细胞融合度达到６０％一８０％时，将ＧＬＰ一１Ｒ　质粒和报告基因质粒按照１：５的比例共转染到　ＣＨＯ细胞中，转染试剂为ＣｙｔｏＰｕｒｅＴＭ，用筛选培养　基（ＲＰＭＩ１６４０完全培养基，６００　ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８）　继续培养，及时除去死细胞。挑取单克隆，并用　ＣＲＥ的激活剂Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ和内源配体ＧＬＰ一１检测荧　光素酶的表达，选取荧光素酶表达量最高的单克隆　（细胞内含有ＧＬＰ一１Ｒ质粒和报告基因质粒）作为　筛选细胞株。　建立阴性对照株：将ｐＣＤＮＡ３．１载体和报告基　因按照１：５的比例共转染到ＣＨＯ细胞中，用筛选　培养基筛选，挑取单克隆，并用ＣＲＥ的激活剂　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ检测荧光素酶的表达，选取荧光素酶表达　量最高的单克隆作为阴性细胞株。　１．５荧光素酶报告基因的检测　用含血清量为　＝３％的ＲＰＭＩ１６４０培养基收　集细胞，接种于９６孔板中，每孔９０　Ｌ。置３７　ｏＣ、　＝５％ＣＯ：孵箱中培养２４　ｈ后，每：ｆＬ￣Ｈ人１０　Ｌ化合物样品，通过检测其信号来优化筛选模型。　２　实验结果　２．１筛选条件的优化　２．１．１　细胞接种密度为了检验不同细胞接种数　目对筛选的影响，我们分别接种了２　Ｘ　１０　／：ｆＬ，４　Ｘ　１０　／：ｆＬ，６　Ｘ　１０　／：ｆＬ，８　Ｘ　１０　／：ｆＬ，１０　Ｘ　１０　／：ｆＬ　５　个密度的细胞于９６孔板，利用ＧＬＰ一１刺激，培养　８　ｈ后检测，结果见图１。随着细胞密度的增加，　荧光素酶的信号值逐渐增大，到密度为８　Ｘ　１０　／孔　时达到最大值，超过８　Ｘ　１０　／：ｆＬ后其值下降。　荧光素酶的表达与受体的数量有密切关系，当　ＧＬＰ一１浓度一定时，受体越少即细胞数目越小，结　合的ＧＬＰ一１就越少，则信号值就越弱。反之，受　体越多即细胞数目越大，结合的ＧＬＰ一１就越多，　则信号值就越高。但是细胞密度过大，会造成孔内　细胞生长受阻以及细胞死亡，受体的表达也会相应　减少，所以其荧光素酶的表达量较低，信号值降　低。故只有当细胞数目在一个合适的范围内时，其　生长量才与荧光素酶的表达成正比。　本实验发现当细胞密度为４　Ｘ　１０　／：ｆＬ时所检测　到的信号值已经较高，完全能适应分析要求，故为　不浪费细胞资源，本实验采用４　Ｘ　１０　／：ｆＬ的细胞密　度。　ｌｇ［ＧＬＰ・１］／（ｍｏｌ・Ｌ　）　＋２００００＋４００００＋６００００—０—８００００＋１０００００　图１　不同细胞接种数目对报告基因检测的影响　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙ　２．１．２　荧光素酶的表达时间　激动剂与受体作用　后，会启动一系列的反应，引发荧光素酶的表达。　为了确定荧光素酶的最佳表达时间，我们将细胞以　４　Ｘ　１０　／：ｆＬ的密度接种于９６孔板中，加入１００　ｎｍｏｌ／Ｌ的ＧＬＰ一１，分别在２，４，６，８，１０，１２　ｈ　时测量其信号值，结果见图２。在８　ｈ内随着时间　增加，荧光素酶的表达增加，在６—８　ｈ内荧光素　酶的表达较高且信号稳定，至８　ｈ时达到最大值，　而８　ｈ后随时间增加其信号明显下降。因此在实验　中我们选择８　ｈ作为荧光素酶的表达时间。　２　４　６　８　１０　１２　１　４　ｔ／ｈ　图２不同表达时间对报告基因检测的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙ　维普资讯 http://www.cqvip.com

第５期　范益军等：胰升血糖素样肽一１受体激动剂高通量筛选细胞模型研究　２．１．３　Ｂｒｉｇｈｔ—Ｇｌｏ　试剂的用量　在荧光素酶报告　受体是否会干扰最终的信号检测。　加Ｏ　如Ｏ　ｍ帅　Ｏ　Ｏ　基因分析中，为降低筛选成本，我们比较不同浓度　的Ｂｒｉｇｈｔ．ＧｌｏⅢ试剂：原液、２倍稀释、４倍稀释、　８倍稀释，以选定最佳的试剂浓度，结果见图３。　随着稀释度的增加，信号值呈下降趋势，但是２倍　稀释和４倍稀释时与原浓度相比，信号值没有很明　显的变化，８倍稀释时有所下降。因此在实验中我　们采用４倍稀释。　７　—６　５　～６　—５　５　—５　ｌｇ［ＧＬＰ一１］／（ｍｏｌ・Ｌ一　）　ｌＢＧ—．广－ｌ：２ＢＧ—．卜＿ｌ：４ＢＧ－．０＂－ｌ：８ＢＧ　图３　不同底物浓度对报告基因检测的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａＳＳａｙ　２．１．４　ＤＭＳＯ的用量　由于二甲亚砜（ＤＭＳＯ）　对细胞生长和信号传导有影响，因此我们分析了不　同质量分数ＤＭＳＯ对ＧＬＰ．１受体细胞株的荧光素　酶表达的影响，结果见图４。当ＤＭＳＯ质量分数低　于１％时，对细胞株的荧光素酶表达影响较小，而　超过１％时其表达量急剧下降。因此在实验中每个　孔所加的ＤＭＳＯ其终极质量分数均应小于１％。　３　・　Ｏ．５　Ｏ　Ｏ．５　ｌ　３　５　７　ｗ（ＤＭＳＯ）／％　图４　ＤＭＳＯ质量分数对报告基因的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＭＳＯ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙ　２．２　ＧＬＰ一１受体细胞株内源干扰性的检测　ＣＨＯ细胞株是常用的研究Ｇ蛋白偶联受体的　细胞株，但由于其内部信号通路不清楚，利用该细　胞株作为ＧＬＰ．１受体宿主时，需要检验其内源性　我们用不同浓度的ＧＬＰ一１分别刺激ＧＬＰ一１Ｒ细　胞株和阴性对照株，结果见图５。在ＧＬＰ．１Ｒ细胞　中荧光素酶的表达与ＧＬＰ一１的浓度呈正比关系，　而用不同浓度ＧＬＰ．１刺激阴性细胞株时，发现其　响应值非常低，与空白对照接近。因此内源干扰性　可以排除，表明ＧＬＰ一１Ｒ细胞株完全可用于高通量　筛选。　１４００　１２００　１０００　８００　６００　０　。０　７．ｂ　－７　一ｂ．ｂ　—ｂ　—　．ｂ　～　Ｉｇ［ＧＬＰ—１］／（ｍｏｌ・Ｌ　）　●一●：ＧＬＰ—ｌ受体细胞株▲一▲：阴性对照株　图５　ＧＬＰ—ｌＲ细胞株和阴性细胞株响应的比较　Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｏｆ　ＧＬＰ—ｌ　Ｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　２．３筛选方法的评估　ｚ　因子是一个常用于判断高通量筛选模型稳定　性的统计学参数　Ｊ，其公式为：　３５阳性＋３５空白　Ｚ　＝１一＿二　．　—＝＿二＝＝　阳性一　空白　如果Ｚ　＜０．５则说明分析条件还需要进一步优　化，或者该检测形式无法得到有效的数据。如果　Ｚ　１＞０．５说明该系统有良好的稳定性，适用于高通　量筛选。　为了评估本筛选模型是否稳定地适用于高通量　筛选，我们随机选取９６孔板的６０个孔，其中３０　个孔加入ＧＬＰ一１作为阳性对照，另外３０个孔作为　空白对照，连续检测３　ｄ，从而计算出Ｚ　＝０．７５，　大于０．５，表明该模型适合高通量筛选。　结果阳性对照与空白对照的Ｘ－Ｉ，－Ｓ／ＲＵＬ分别为　９６７．３±４５．５，２３６．５士１５．３，而ＣＶ／％分别为４．７，　６．５。　２．４中药筛选　以２００种２型糖尿病治疗中草药为研究对象，　对其进行提取，利用优化后的ＧＬＰ一１受体激动剂　筛选模型对中药醇提物进行检测，有ｌ０种中药激　活荧光素酶表达的读数超过背景值的２倍，接近　１００　ｎｍｏｌｆＬ的ＧＬＰ一１刺激时的读数（见图６）；在　这ｌ０个样品中，有５个样品能激活阴性对照细胞　株（见图７），即为假阳性，而其它５种中药中就　有直接激活ＧＬＰ．１受体的活性物质。　维普资讯 http://www.cqvip.com 中山大学学报（自然科学版）　第４６卷　ｒ一一ｒ　＿－　ｌ一　０　ｎ删帅㈣　　０　０　Ｏ　㈣　０　Ｏ　。　３　ｊ【＿　　１Ｏ０　ｔ　５０　２００　２５（）　ｃ（中药）／（ｎｍｏｌ・Ｌ。。）　图６　ＧＬＰ。１受体筛选结果　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＧＬＰ一１　Ｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　２５（）０　２０００　１５００　１０００　５００　（）　Ｉ　Ｉ　Ｉ－Ｉ－　Ｉ¨　３　４　５　６　７　８　９　１０　ｃｅｌｌ　ＧＬＰ　样品　图７　阴性细胞株筛选结果　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　３讨论　ＧＬＰ一１受体属于七跨膜区受体族，是一种选择　性和组织特异性蛋白质　。］。最先在大鼠的胰岛素　细胞瘤的细胞株中发现，其主要第二信使是　ｃＡＭＰ，当细胞外葡萄糖浓度增加时，葡萄糖进入　１３细胞被氧化使细胞内的ＡＴＰ含量增加，ＡＴＰ与　ＡＴＰ敏感的Ｋ　通道结合，导致Ｋ　通道关闭，细　胞膜去极化，于是Ｃａ　通道开放，Ｃａ　内流，刺　激胰岛素从１３细胞排出　。因此，ＧＬＰ一１受体是　２型糖尿病治疗中非常重要的药靶基因。　根据Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲｓ）的信号通路　特性，其高通量筛选模型大致可以分为３类：第１　类基于受、配体结合检测的分析方法，包括　ＦＭＡＴ、ＦＰ和ＳＰＡ；第２类是基于第二信使检测的　分析方法，包括ｃＡＭＰ的ＥＬＩＳＡ分析、ＭＡ和ｃａ“　测定；第３类是基于受体功能反应的报告基因检测　方法。在这３类方法中，基于受体功能反应的报告　基因检测方法易于区分激动剂和拮抗剂，且操作简　单，是筛选受体激动剂和拮抗剂的最有效也是最常　用的方法。　研究中，利用ＧＬＰ一１受体基因、荧光素酶报　告基因和响应元件（ＭＲＥ、ＣＲＥ、ＳＲＥ）建立了　ＧＬＰ一１受体激动剂的高通量筛选的稳定细胞株。当　配体与ＧＬＰ一１受体相结合时，就会激活其相应的　信号通路，荧光素酶报告基因响应这种信号，在细　胞内大量表达，通过检测细胞质中荧光素酶的活　性，可以评估配体的功能性作用和进行高通量筛　选。　在报告基因质粒构建中，我们选择的响应元件　为ＭＲＥ、ＣＲＥ和ＳＲＥ。ＭＲＥ为多重响应元件，响　应ＰＫＡ和ＰＫＣ信号通路　…；ＣＲＥ为ｃＡＭＰ响应元　件，响应ＰＫＡ信号通路…　；ＳＲＥ为血清响应元　件，响应ＰＫＣ信号通路　。ＧＬＰ一１受体属于Ｇ蛋　白偶联受体中Ｇｓ型受体，结合其信号通路，我们　选取了３种响应元件，构建了３　Ｘ　ＣＲＥ／３　Ｘ　ＭＲＥ／　ＳＲＥ—ＬＵＣ／ｐＧＬ３的报告基因质粒。能够完全监控　ＧＬＰ一１受体激活后引发的信号变化。　虽然响应元件能灵敏监测第二信使的变化，但　是引起第二信使变化的因素很多，可能出现不通过　ＧＬＰ一１受体激活报告基因表达的现象。因此我们同　时建立了一个仅含响应元件和报告基因的细胞株，　作为筛选的阴性对照来排除假阳性。　在细胞株的建立中，由于ｐＧＬ３载体不带抗性　标记，而ｐＣＤＮＡ３．１载体自带Ｇ４１８抗性标记，无　法进行二步转染，所以我们利用两种载体构建质　粒，按１：５比例一步共转染ＣＨＯ细胞。当ＧＬＰ一１　作用于其受体细胞株８　ｈ时，报告基因达到最大稳　定表达，而其后，表达量降低，可能是由于脱敏作　用的原因。　本实验中，我们采用了报告基因检测方法，将　ＧＬＰ一１受体质粒和报告基因质粒共同转染到ＣＨＯ　细胞中，并对筛选条件进行优化，建立了ＧＬＰ一１　受体激动剂高通量筛选模型，通过该模型对中药提　取物进行检测，发现活性物质，通过分离纯化等进　一步研究就可得到其激动剂。　参考文献：　［１］　范益军，欧阳克清，王贵学，等．胰升血糖素样肤一１及　其受体与２型糖尿病的治疗［Ｊ］．生物化学与生物物　理进展，２００５，３２（５）：３９３—３９６．　［２］　黄家学，胡娟娟，杜冠华．化合物药物活性的高通量筛　选［Ｊ］．中国药理学通报，１９９９，１６（５）：４０１—４Ｏ４．　［３］　梁乾的，王升起．药物高通量筛选分析技术［Ｊ］．国外　医学：药理学分册，２００２，２９（１）：２２—２８．　［４］　ＪＩＡＮＧ　Ｃ，ＣＨＥＮ　Ｇ，ＺＥＮＧ　Ｘ，ｅｔ　１ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏ—　ａｃｔｉｖｅ　ｎｅｕｒｏｐｅｐｉｔｄｅ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ—ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏ—　ｃｈｅｍ，２００３，３１６（１）：３４—４Ｏ．　Ｉ　５　ｌ　ＺＨＡＮＧ　Ｊ　Ｈ。ＣＨＵＮＧ　Ｔ　Ｄ，ＯＬＤＥＮＢＵＲＧ　Ｋ　Ｒ．Ａ　ｓｉｍ—　ｐｌｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖａｌｉｄａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｍｏｌ　Ｓｃｒｅｅｎ，１９９９，４（２）：６７—７３．　、　［６］　ＢＡＶＥＣ　Ａ，ＨＡＬＬＢＲＩＮＫ　Ｍ，ＬＡＮＧＥＬ　Ｕ，ｅｔ　１ａ．Ｄｉｆｅｒ－　维普资讯 http://www.cqvip.com

第５期　范益军等：胰升血糖素样肽一１受体激动剂高通量筛选细胞模型研究　２００４，５３（１）：５—１３．　８７　ｅｎｔ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｏｐｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃａｇｏｎ・・ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－－１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　Ｇ—ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｒｅｇｕｌ　Ｐｅｐｔ，２００３，１　１　１　（１—３）：１３７一ｌ４４．　ＤＥＮＯＲＦＥＲ　Ｕ，ＯＥＴＦＧＥＮ　Ｐ，ＬＩＢＥＲＭＡＮＮ　Ｔ　Ａ．Ｍｕｌ・　ｔｉｐｌｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６　ｇｅｎｅ　ｍｅｄｉ—　ａｔｅ　ｉｎｄａｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ，ａｎｄ　ｌｉｐｏｐｏ・　［７］　ＲＵＮＧＥ　Ｓ，ＷＵＩ　ＦＦ　Ｂ　Ｓ，ＭＡＤＳＥＮ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃａｇｏｎ　ａｎｄ　ｇｌｕｃａｇｏｎ－－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ・・１　ｒｅ－－　ｃｅｐｔｏｒｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖ—　ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９９４，１４（７）：４４４３—　４４５４．　ｉｔｙ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｎｌａｃｏｌ，２００３，１３８（５）：７８７—７９４．　［８］　ＭＡＣＤＯＮＡＬＤ　Ｐ　Ｅ，ＳＡＬＡＰＡＴＥＫ　Ａ　Ｍ，ＷＨＥＥＬＥＲ　Ｍ　Ｂ．Ｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｔａｇｏｎｉ—　ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ　Ｄ，ＧＲＯＵＳＳＩＮ　Ｌ，ＪＵＬＬＩＡＮ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＫＡ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＣＲＥＢ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．　Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ，２００２．９６８：６５—７４．　ＳＴＲＡＴＯＷＡ　Ｃ，ＭＡＣＨＡＴ　Ｈ，ＢＵＲＧＥＲ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．　ｚｅｓ　ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ　Ｋ（＋）ｃｕｒｒｅｎｔｓ　ｉｎ　ｂｅ—　ｔａ—ｃｅｌｌｓ：Ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００２，５１（３）：４４３—４４７．　［９］　ＨＯＬＺ　Ｇ　Ｇ．Ｅｐａｃ：Ａ　ｎｅｗ　ｃＡＭＰ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｓｕｐ—　ｐｏｒｔ　ｏｆ　ｇｌｕｃａｇｏｎ－－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－－１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ・・ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ　Ｉ℃．　ｃｅｐｔｏｒｓ　ＮＫ１，ＮＫ２，ａｎｄ　ＮＫ３　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｃｅｌｌｕａｒ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｒｅｃｅｐｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ　Ｒｅｓ，１９９５，１５　（１—４）：６１７—６３０．　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｂｅｔａ—ｃｅｌｌ［Ｊ］．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，　ｒＬ　ｒＬ　ｒＬ　１Ｊ　１Ｊ¨　　１Ｊ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　Ａｇｏｎｉｓｔ　ｏｆ　Ｇｌｕｃａｇｏｎ－・Ｌｉｋｅ　Ｐｅｔｉｄｅ－・１　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＦＡＮ　Ｙｉ－ｊｕｎ　一，ＯＵＹＡＮＧ　Ｋｅ—ｑｉｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｇｕｉ—　，ＬＵＯ　Ａｏ．ｘ／／．，ｅ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００４４，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｕｊｉａｎｇｙａｎ　６１１８３０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉ￣ｉｎｇ　ａｇｏｎｉｓｔｓ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅ　ｐｅｔｉｄｅ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＬＰ一１　Ｒ），ａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ｕｐ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＧＬＰ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ（ＧＬＰ一１　Ｒ／ｐＣＤＮＡ３．１）ａｎｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｐｌａｓｍｉｄ（３×ＣＲＥ／３×ＭＲＥ／ＳＲＥ—ＬＵＣ／ｐＧＬ３）ｗｅｒｅ　ｃｏ—ｔｒａｎｓｆｅｃｔｔｅｄ　ＣＨＯ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：５．Ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＧＬＰ一１，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　Ｂｒｉｇｈｔ—ＧｌｏⅢａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＭＳＯ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｔｅａｄｙ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．ａ　ｒｅｌｉａ—　ｂｌｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒ　ＧＬＰ一１　Ｒ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｔｈｅ　Ｚ＇－ｆａｃｔｏｒ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　０．７５　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　４×１０　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｗｅｌｌ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｆｏｒ　８ｈ　ｕｓｉｎｇ　４　ｔｉｍｅｓ　ｄｉｌｕｔｅｄ　Ｂｒｉｇｈｔ—Ｇｌｏ　ａｎｄ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　１％ＤＭＳＯ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ａｓｓａｙｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｏｄｅｌ，ａｎｄ　ｆｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｓｃｒｅｅｎ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｆｏｒ　ＧＬＰ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＧＬＰ一１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ－ｍｅｌｌｉｔｕｓ；ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ