奶油实验方案

微生物检验实验方案设计

2011年 9 月18日

奶油 微生物学检测 设计方案 奶油的测定（GB 196-2010）

项目 菌落总数 大肠菌群 金黄色葡萄采样方案a及限量（若非制定，均以CFU/g或CFU/ml表示） n 5 5 5 c 2 2 1 m 10000 10 10 M 100000 100 100 GB47.2 GB47.3 MPN计数法 GB47.10 检测方法 球菌 沙门氏菌 霉菌≤ 5 0 90 0/25g(ml) - 定性检验 GB47.4 GB47.15 A：样品的分析及处理按GB47.1和GB47.18执行。 B：不适用于以发酵稀奶油为原料的产品。 时间 细菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 2011-9-20 无菌锥形瓶（500ml 2个、300ml 4个、100ml 2个）、无菌烧杯（300ml 1个）、无菌移液管（10ml 2个、1ml 6个）、无菌试管（18×180mm 30个）、无菌培养皿（直径90mm 14个）、剪刀（1把）、生理盐水（300ml）、平板计数琼脂培养基（200ml）、LST肉汤（120ml pH 6.6-7.0）、7.5%氯化钠肉汤（250ml pH7.4） BGLB肉汤（120ml pH 7.1-7.3）、血琼脂平板（50ml）、 Baird-Parker平板(50ml pH 6.8-7.2) 2011-9-25 稀释(0.1、0.01、稀释(0.1、0.01、0.001、样品加入7.5%氯化钠肉汤0.001、0.0001)、倒平0.0001)、接种（LST肉中培养（36℃、24h） 板、接种、培养（36℃、汤）、培养(36℃、24h) 24h） 观察、计数 产气者接入BGLB肉汤、培划线接种到血琼脂平板和 养（36℃、24h） Baird-Parke平板培养（36℃、24h） 观察、报告 可疑菌落接种到BHI肉汤、培养（36℃、24h） 进行血浆凝固酶试验观察 2011-9-26 2011-9-27 报告 2011-9-28

一、 准备内容：

1、无菌器材准备表： 仪器名称 平板培养皿 1ml移液管 10ml移液管 玻璃棒 试管 烧杯 锥形瓶 数量 12 5 1 1 25 3 3

2、培养基、试剂准备表： 名称 BPW LST BGLB 氯化钠肉汤 B-P琼脂平板 平板计数琼脂培养基 生理盐水 体积（ml） 225 100 100 225 50 150 225、100 备注：

无菌生理盐水

氯化钠 2. 5g 蒸馏水300ml 平板计数琼脂

有现成的培养基，直接称取即可，配制120ml

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨 2.0g 氯化钠 0.5 g 乳糖 0.5 g

磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.275 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.275g 月桂基硫酸钠 0.01 g 蒸馏水 100 mL

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。

煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨 1 g 乳糖 1.0 g

牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 20 mL 0.1%煌绿水溶液 1.33 mL 蒸馏水 80mL pH 7.2±0.1 A.2.2 制法 将蛋白胨、乳糖溶于约50mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液20 mL（将2.0 g脱水牛胆粉溶于20 mL 蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液1.33 mL，

用蒸馏水补足到1 00mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 7.5%氯化钠肉汤 蛋白胨 2.25g 牛肉膏 1.125g 氯化钠 16.875 g

蒸馏水 225mL pH 7.4

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225 mL，121 ℃高压灭菌15 min。 Baird－Parker琼脂平板 胰蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.25 g 酵母膏 0.05g 丙酮酸钠 0.5g 甘氨酸 0.6g 氯化锂（LiCl·6H2O） 0.25g 琼脂 1.0 g

蒸馏水 47.5mL pH 7.0±0.2 增菌剂的配法

30%卵黄盐水50 mL 与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10 mL 混合，保存于冰箱内。 A.4.3 制法

将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。121 ℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，冷至50 ℃，每95 mL 加入预热至50 ℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48 h。

二、实验内容：

菌落总数的检测

1、样品的稀释

1.1 液体样品：称取25 g样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶，摇匀，制成1:10 的样品匀液。

1.3 用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 1.4 另取1 mL 无菌吸管，按上述操作程序，制备1:1000稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。

1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿20mL左右，并混合均匀，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

2、培养

2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，置于36 ℃±1 ℃恒温箱中培养48 h±2 h。

3、菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数

以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果与报告

4、菌落总数的计算方法

4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。

4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。

4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5、菌落总数的报告

5.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 5.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

5.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 5.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。

大肠菌群计数

1.样品稀释

1.1 液体样品：量取25g奶油盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中，摇匀制成1:10样品均液。

1.2 用1 mL 无菌移液管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

1.3 另用1 mL 无菌移液管，按上述操作，制成1:1000 的样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 2 初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤（即3个平行样），每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤）于无菌平板内，及时将凉至46℃伊红美蓝琼脂培养基注入

平皿20mL左右，并混合均匀，置于36℃±1 ℃恒温箱中培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验。 3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1ml，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

霉菌的检验

1 样品的稀释

1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。

1.4 按5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。

1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包

括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。

1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

2、培养

2.1待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d。

3观察并记录

金黄色葡萄球菌检验

1.样品的稀释

1.1称取25g奶油至盛有225ml7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。将上述样品匀液于36℃培养18-24h。

1.2将上述培养物分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，于36℃培养18-24h。观察

菌落形态，挑取典型菌落进行血浆凝固酶试验。挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mlBHI和营养琼脂小斜面，36℃培养18-24h。

1.3取新鲜配置兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入入BHI培养物0.2-0.3ml，振荡摇匀，于36℃温箱内，观察6h，如呈现凝固或凝固体积大于原体积的一半，判定结果为阳性。同时以血浆凝固酶试验阴性和阳性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作对照。

2观察结果与报告

沙门氏菌检验

三、实验记录

1、细菌总数记录表 培养皿 1 2

2、大肠菌群计数记录表 稀释度 10-1 10-2 10-3 空白 10-1 10-2 10-3 空白 N=∑C/(n1+0.1n2)d 菌落总数计算公式 菌落总数 培养基 3支LST管肉汤管 3支BGLB肉汤管

3、霉菌总数计数记录表 培养皿 1 2

七、附录：

10-1 10-2 10-3 空白 N=∑C/(n1+0.1n2)d 霉菌总数计算公式 霉菌总数 1、大肠菌群最可能数（MPN）检索表

2、实验中国标参照食品微生物检验实验讲义