一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112391344 A(43)申请公布日 2021.02.23

(21)申请号 202011296155.6(22)申请日 2020.11.18

(71)申请人 广东先康达生物科技有限公司

地址 523000 广东省东莞市松山湖园区新

城路9号6栋201室(72)发明人 薛卫巍　谢海涛　钟家炜　刘元甲　(74)专利代理机构 东莞卓诚专利代理事务所

(普通合伙) 447

代理人 朱鹏(51)Int.Cl.

C12N 5/0783(2010.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图2页

()发明名称

一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法(57)摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法。一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法，包括以下步骤：(1)分离血清和全血细胞；(2)灭活血清；(3)获取单个核细胞；(4)重悬单个核细胞；(5)诱导NK细胞；(6)扩增NK细胞。本发明不需要包被，操作简单，经过激活培养基培养和增殖培养基使得NK细胞能够优势生长，NK的流式含量和扩增倍数较高，能够适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

CN 112391344 ACN 112391344 A

权　利　要　求　书

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1.一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离血清和全血细胞：取50mL血液置于离心管中离心，获得血清和全血细胞；(2)灭活血清；

(3)获取单个核细胞；(4)重悬单个核细胞：第0d收集的单个核细胞，分出0.6-10×107数量的细胞，用40mL含有10％血清的激活培养基重悬后，转入培养瓶，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；

(5)诱导NK细胞：第3d补加50mL含有10％血清的激活培养基；第5d补加100mL含有10％血清的激活培养基；

(6)扩增NK细胞：第7d后，每2d补加扩增培养基，并控制细胞浓度在1.0×106/mL；培养至第13-20d后将细胞培养液转入离心管，离心50-100g，10-20min，用生理盐水洗涤2-3次，即获得高纯度，高活性的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，步骤(1)中需要对血液进行检测：血液梯度离心获取单个核细胞后，检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体和巨细胞病毒lgM抗体均为阴性。

3.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，步骤(2)灭活血清的具体操作为：血清放入56℃水浴中灭活20min后，置于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，置于2-8℃环境中保存。

4.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，步骤(3)获取单个核细胞的具体操作为：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞。

5.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，步骤(4)和(5)的激活培养基为添加有lL-2、lL-12、lL-15、lL-18、CD16单克隆抗体和HER2单克隆抗体中一种或多种的无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-12的浓度为5-100ng/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL、lL-18的浓度为10-200ng/mL、CD16单克隆抗体的浓度为50-200ng/mL、HER2单克隆抗体的浓度为0.1-20μg/mL。

7.根据权利要求1所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，步骤(6)的扩增培养基添加有lL-2和lL-15中一种或多种的无血清培养基。

8.根据权利要求8所述的无包被NK细胞体外扩增和培养方法，其特征在于，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL。

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一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法

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技术领域

[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法。

背景技术[0002]肿瘤作为重大疾病一直困扰人类的健康。随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但目前仍然由于肿瘤的复杂性、多样性、可变性和异质性，找不到一种更好的治疗方法。目前医疗行业内对癌症的治疗方法有手术切除、化学疗法及放射线疗法，但对人体的损伤较大。而过继性免疫疗法引起靶向性突出、副反应较少、干预方式简单等优点成为当今用于研究肿瘤治疗的热点，而且在临床得到广泛的应用。[0003]NK细胞因其无MHC、肿瘤杀伤范围广、免疫响应速度快而成为过继性免疫疗法的突出细胞之一。NK细胞又称自然杀伤细胞，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键部分，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。[0004]近年来，NK细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。据国内外相关报道，体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是磁珠分选法，从单个核细胞得到纯化的NK细胞，体外扩增；二是利用饲养层细胞培养NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且磁珠分选法成本价高、饲养层细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究；第三种利用细胞因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但需要激活因子包被，因其需要在冰箱或二氧化碳培养箱中孵育数小时，会导致操作不方便和增大染菌风险。因此，寻找一种成本低、无外源血清、无饲养层细胞、无需包被、操作简单且扩增倍数高的NK细胞体外培养方法是很有必要的。

[0005]公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。发明内容

[0006]本发明目的在于为了克服目前NK细胞体外培养的成本高、使用外源血清、使用饲养层细胞、流式结果低、因包被操作繁琐和增加染菌风险等因素，用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CD16单克隆抗体、HER2单克隆抗体提刺激诱导NK细胞，自体血清保证营养，再用含有IL-2、IL-15的无血清完全培养基扩增，得到大量高纯度的NK细胞。[0007]为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：[0008]一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法，包括以下步骤：[0009](1)分离血清和全血细胞：取50mL血液置于离心管中离心，获得血清和全血细胞；[0010](2)灭活血清；

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(3)获取单个核细胞；

[0012](4)重悬单个核细胞：第0d收集的单个核细胞，分出0.6-10×107数量的细胞，用40mL含有10％血清的激活培养基重悬后，转入培养瓶，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；[0013](5)诱导NK细胞：第3d补加50mL含有10％血清的激活培养基；第5d补加100mL含有10％血清的激活培养基；[0014](6)扩增NK细胞：第7d后，每2d补加扩增培养基，并控制细胞浓度在1.0×106/mL；培养至第13-20d后将细胞培养液转入离心管，离心50-100g，10-20min，用生理盐水洗涤2-3次，即获得高纯度，高活性的NK细胞。[0015]作为优选，步骤(1)中需要对血液进行检测：血液梯度离心获取单个核细胞后，检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体和巨细胞病毒lgM抗体均为阴性。[0016]作为优选，步骤(2)灭活血清的具体操作为：血清放入56℃水浴中灭活20min后，置于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，置于2-8℃环境中保存。[0017]作为优选，步骤(3)获取单个核细胞的具体操作为：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞。[0018]作为优选，步骤(4)和(5)的激活培养基为添加有lL-2、lL-12、lL-15、lL-18、CD16单克隆抗体和CTLA-4中一种或多种的无血清培养基。[0019]作为优选，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-12的浓度为5-100ng/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL、lL-18的浓度为10-200ng/mL、CD16单克隆抗体的浓度为50-200ng/mL、HER2单克隆抗体的浓度为0.1-20μg/mL。[0020]作为优选，步骤(6)的扩增培养基添加有lL-2和lL-15中一种或多种的无血清培养基。

[0021]作为优选，lL-2的浓度为100-3000lU/mL、lL-15的浓度为10-200ng/mL。[0022]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0023](1)本发明仅使用有明确来源的细胞因子、无血清培养基和自体血清，配制成激活培养基和扩增培养基，做到成本低、无需包被、操作简单、稳定性强、NK细胞含量高。[0024](2)本发明不需要包被，操作简单，经过激活培养基培养和增殖培养基使得NK细胞能够优势生长，经过14天的培养，扩增倍数可达1000倍以上，经流式细胞仪检测，CD3-C56+所含的比例可达80-96％之间，有利于产业化生产。附图说明

[0025]图1为实施例1增后的人外周血NK细胞比例的流式细胞术检测结果；[0026]图2为实施例2增后的人外周血NK细胞比例的流式细胞术检测结果；[0027]图3为实施例3增后的人外周血NK细胞比例的流式细胞术检测结果。

具体实施方式

[0028]下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技

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术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029]实施例1

[0030]一种无包被NK细胞体外扩增试剂盒和培养方法，具体步骤如下：[0031](1)采集志愿者外周血，梯度离心获得单个核细胞单个核细胞：检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性；[0032](2)分离血清和全血细胞：抽取50mL血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50mL的离心管中，离心后，得到血清和全血细胞；[0033](3)灭活血清：血清放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，保存于2-8℃环境；[0034](4)获取单个核细胞：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞单个核细胞，备用；[0035](5)重悬单个核细胞：第0d收集得到的单个核细胞，分出5×107数量的细胞，用40mL含有10％自体灭活血清的激活培养基重悬，转入培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3d；在此步骤中，激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、80ng/mL的IL-15、100ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体、5μg/mL的HER2单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[0036](6)诱导NK细胞：第3d向培养瓶中补加50mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；第5d，补加100mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；在此步骤中激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体、5μg/mL的HER2单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[0037](7)扩增培养NK细胞：第7d后，每2d取样检测细胞含量，补加扩增培养基，控制细胞浓度在1.0ⅹ106/mL；第14d，将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；在此步骤中，扩增培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15的Corning88-581-CM培养基。[0038]实施例2

[0039]一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法，具体步骤如下：[0040](1)采集志愿者外周血，梯度离心获得单个核细胞单个核细胞：检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性；[0041](2)分离血清和全血细胞：抽取50mL血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50mL的离心管中，离心后，得到血清和全血细胞；[0042](3)灭活血清：血清放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，保存于2-8℃环境；[0043](4)获取单个核细胞：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞单个核细胞，备用；

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(5)重悬单个核细胞：第0d收集得到的单个核细胞，分出5×107数量的细胞，用

40mL含有10％自体灭活血清的激活培养基重悬，转入培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3d；在此步骤中，激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、80ng/mL的IL-15、100ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[0045](6)诱导NK细胞：第3d向培养瓶中补加50mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；第5d，补加100mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；在此步骤中激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[0046](7)扩增培养NK细胞：第7d后，每2d取样检测细胞含量，补加扩增培养基，控制细胞浓度在1.0ⅹ106/mL；第14d，将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；在此步骤中，扩增培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15的Corning88-581-CM培养基。[0047]实施例3

[0048]一种无包被NK细胞体外扩增和培养方法，具体步骤如下：[0049](1)采集志愿者外周血，梯度离心获得单个核细胞单个核细胞：检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性；[0050](2)分离血清和全血细胞：抽取50mL血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50mL的离心管中，离心后，得到血清和全血细胞；[0051](3)灭活血清：血清放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境中速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血清，保存于2-8℃环境；[0052](4)获取单个核细胞：全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞单个核细胞，备用；[0053](5)重悬单个核细胞：第0d收集得到的单个核细胞，分出5×107数量的细胞，用40mL含有10％自体灭活血清的激活培养基重悬，转入培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3d；在此步骤中，激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、80ng/mL的IL-15、100ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体、5μg/mL的HER2单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[00](6)诱导NK细胞：第3d向培养瓶中补加50mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；第5d，补加100mL含有10％自体灭活血清的激活培养基；在此步骤中激活培养基为含有：1000IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-12、50ng/mL的IL-15、50ng/mL的IL-18、100ng/mL的CD16单克隆抗体、5μg/mL的HER2单克隆抗体的Corning 88-581-CM培养基；[0055](7)扩增培养NK细胞：第7d后，每2d取样检测细胞含量，补加扩增培养基，控制细胞浓度在1.0ⅹ106/mL；第14d，将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；在此步骤中，扩增培养基为含有：1000IU/mL的IL-2的Corning 88-581-CM培养基。

[0056]细胞数量检测和CD3-CD56+检测[0057]第0d和第14d检测NK细胞数量及CD3-C56+的流式含量，计算扩增倍数。

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说　明　书

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检测结果见下表1。

表1实施例1-3细胞数量和流式检测结果

组别实施例1实施例2实施例3

第0d NK数量(千万)0.6960.6960.696

第14d NK数量(千万)942.78601.28650.43

CD3-CD56+(％)96.1079.7093.98

扩增倍数13.57863.91934.53

从表1中可以看出，实施例1和3较实施例2的CD3-CD56+含量较高；说明HER2单克隆

抗体前期的持续加入能够促进NK细胞的激活，对NK细胞的流式含量有较大的促进作用；实施例1较实施例3的CD3-CD56+含量相差很小，但扩增倍数相差较大，说明后期扩增中IL-15对NK细胞的扩增倍数有促进作用。[0062]综上所述，本发明不需要包被，操作简单，经过激活培养基培养和增殖培养基使得NK细胞能够优势生长，NK的流式含量和扩增倍数较高，能够适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

[0063]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

[0061]

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

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