离子束注入黑曲霉选育单宁酶高产菌株及其发酵工艺研究刘会郑之明贡国鸿聂光军中国科学院离子束生物工程学重点实俭室摘要：为获得单宁酶高产菌株，利用低能盯注入技术对黑曲霉原始菌株ＴＡ９７０１进行诱变选育。在最佳辐照能量与剂量条件下，经过多轮注入，最终筛选到一株高产菌株Ｊ—Ｔ１８。通过对底物浓度，接种量，通气量及发酵温度等发酵条件进行优化，突变株的单宁酶产量达到了３８．５Ｕ／ｍＬ，较原始菌株提高了近四倍，且遗传性能稳定。同时研究了金属离子和表面活性剂对突变株产酶的影响，结果表明Ｍｎ２＋与Ｓｎ２＋对菌株产酶有促进作用。关键词；离子注入单宁酶黑曲霉选育发酵优化低能离子注入的生物学效应发现于上世纪八十年代中期，作为一门新兴的边缘学科，目前已在植物、微生物诱变育种“’２’及植物基因转移Ｄ１等方面取得广泛应用。离子注入生物体集能量沉积、动量传递、质量沉积及电荷交换等效应“＾６１，同时还具有高的ＬＥＴ（传能线密度）值、集束性好、射程可控、能量沉积和质量沉积区域可控等特点订一’９１，可以在损伤较轻的情况下，获得更高的突变率和更宽的突变谱。近年来，将离子束用于工业微生物的诱变育种工作，已经取得了可喜的成果。单宁酶（ＥＣ．３．１．１．２０）是一种以单宁酸作为诱导物的诱导酶，广泛存在于各种微生物中。它可以水解单宁或没食子酸酯中的酯键与缩酚酸键，生成没食子酸及其他化合物‘１¨。单宁酶在很多行业都有很重要的用途，主要用于饮料、精细化工、皮革、饲料、化妆品ｎ０’儿１等方面。另外，在医药工业，特别是在生产没食子酸衍生物甲氧苄氨嘧啶中也具有很重要的用途。１．材料与方法１．１菌种黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ１．２培养基ｎｉｇｅｒＴＡ９７０１），本研究室保存。菌种保存培养基：ＰＤＡ培养基平板培养基（ｇＬ。１）：察氏培养基改良而得。琼脂１５．０，ＮａＮ０３３．０，ＫＨ２Ｐ０４摇瓶发酵培养基（ｇＬ。）：籼米粉５０．０，（ＮＨ４）２Ｓ０４ＣａＣ０３１．０，ＭｇＳ０４０．３，ＦｅＳ０４・７Ｈ２０，微量。单宁酸过滤除菌后加入，终浓度为２％（ｗ／ｖ）１０．０，ＭｇＳ０４０．３，ＫＨ２Ｐ０４３．０，５．０。单宁酸过滤除菌后加入，终浓度为２％（ｗ／ｖ）［１２】．Ｓ２．１．３培养工艺将孢子接种于ＰＤＡ斜面上，３０ｏＣ培养３－４天。取１０ｍＬ无菌水将斜面上的黑曲霉孢子彻底洗脱，并充分混匀使之成孢子悬液。取２ｍＬ孢子悬液（约１０７孢子）接于含５０ｍＬ发酵培养基的２５０ｍＬ锥形瓶中，于３０１．４离子注入诱变选育方法ｏＣ，１８０转／分培养８０ｈ。离子注入机：由中科院离子束生物工程重点实验室自行研制［１３】。诱变处理：用１０ｍｌ的无菌水将斜面上的孢子洗下，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀以便分开所有的孢子。取０．１ｍｌ的孢子悬液均匀涂布于平皿内，无菌风吹干后于注入机靶室内进行脉冲式矿注入【１４】。将处理后的样品每个平皿加入ｌｍｌ的无菌水洗下孢子，稀释并涂入已经准备好的平板培养基中，每个平板中加入０．１ｍｌ孢子悬液，用玻璃涂棒涂匀。接种后的所有平板于３０℃倒置培养３．４天。挑选单菌落转接斜面培养，然后接入摇瓶培养基，筛选高产菌株。１．５分析方法存活率的计算：在每一个注入剂量下同时设置真空对照，对照样品同时放入靶室但不接受离子注入，其余操作与注入平皿相同。培养３天后对单菌落进行计数并计算出注入板上的菌落数和真空对照板上的菌落数之比，即为存活率。菌株突变率的计算方法是：分别在每个注入剂量下随机挑选２０株单菌落，接摇瓶发酵３天后，测酶活，以高出原始菌株酶活的５％以上者为正突变菌株，以低出原始菌株酶活的５％以上者为负突变菌株，计算两种突变类型在所挑选的２０株注入菌中所占的比例分别作为正突变率和负突变率。酶活测定方法：发酵液用滤纸过滤，所得滤液即为粗酶液。酶活测定参照Ｉｉｂｕｃｈｉ［１５］的方法。将单宁酸溶解于Ｏ．０５Ｍ、ｐＨ５．６的柠檬酸缓冲液中，配置成浓度为０．３５％的样品，取样品４份，加入１份酶液，３０℃反应一定时间，沸水浴灭活。取反应液０．１份加入１０份９５％乙醇，３１０ｎｍ比色。根据以下公式计算单宁酶的活性：Ｕ＝１１４ｘＯＤ３ｌｏ／ｔ其中：ＯＤ３ｌｏ为３１０ｎｍ处的光密度，ｔ为反应时间。一个酶活力单位的定义为：一分钟内能降解ｌＪ－ｔｍｏｌ的单宁酸中酯键的酶量。２．结果与讨论２．１注入离子能量与剂量的选择离子注入后菌株的存活率，突变率与筛选效率跟离子的能量跟剂量有很大关系。现代育种理论证明，诱变的微生物致死率在７０．８０％左右时，正突变率往往很高［１６】。也就是说当存活率在２０％．３０％范围时，能得到较高正突变率的菌株。１００邑ｏｈｏ’薹ｏ，ｏ童皂Ｓ∞３詈０５１０１５ｏｆ２０筠３０ＥｎｅｒｇｙＮ＋Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ｋｅｙ）Ｆｉｇ．１ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｅｎｅｒｇｙｏｎｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＴＡ９７０１ａｔｔｈｅｄｏｓｅｏｆ４０ｘ（２．６×１０１３、ｉｏｎｓ／ｃｍ２从图中可以看出，随着注入能量的增大存活率也相应降低。当能量较低时，存活率下降较缓。当能量超过５ｋｅＶ的时候存活率降低的犹为迅速。然而当能量超过１０ｋｅＶ时存活率下降又比较缓慢，并且在ｌＯｋｅＶ时，存活率为２０％．３０％，根据文献中的论证，我们以１０ｋｅＶ作为最佳注入能量。∞∞∞∞∞ｏ０２０∞∞８０１１）０ＤｏｓｅｏｆＮ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ｘ２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２）Ｆｉｇ．２ＥｆｆｅｃｔｏｆＮ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｄｏｓｅａｔｏｎｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＴＡ９７０１ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｎｅｒｇｙｏｆ１０ｋｅＶ从Ｆｉｇ．２可以看出，在０－－一１００ｘ２．６×１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２剂量范围内菌株存活率与剂量之间的关系并不遵循指数定律（对数线性模型），而是呈马鞍型分布。在较低剂量范围内（０－－一２０ｘ２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２）存活率随着剂量的增加而下降很快，在３０ｘ２．６×１０１３－－一４０ｘ２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２的小剂量范围内存活率有上升的趋势，而在之后的剂量范围中，存活率又持续降低。典型的马鞍型曲线可用来解释低能量注入时的异常辐射损伤，很大可能与低剂量时的能量和动量沉积作用和高剂量时的电荷刺激效应相关。侣俘¨让位８６４２Ｏ１０－２０３０－，１０５０４５０７０－８０９０－１００ＤｏｓｅＯｆＮ＋ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ｘ２．６ｘ１０’３ｉｏｎｉａｎ２）Ｆｉｇ．３ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎⅣｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｄｏｓｅａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＴＡ９７０１如图所示，在剂量３０ｘ２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２＂－一６０×２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２的范围内，菌株的正突变率比负突变率高，而在其余剂量负突变率均高于正突变率。综合考虑Ｆｉｇ．２、Ｆｉｇ．３所示的存活率和突变率，我们选定３０ｘ２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２为最佳辐照剂量。２．２离子注入对菌株活性的提高ｉｏｎｓ／ｃｍ２＂－６０ｘ２．６ｘ１０１３经过９次连续离子注入，最终筛选到Ａ．ｎｉｇｅｒＪ－Ｔ１８菌株，该菌株的酶活力为３８．５Ｕ／ｍｌ，较原始出发菌Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒＴＡ９７０１（酶活力约为８Ｕ／ｍ１）提高了将近四倍（Ｆｉｇ．４）。∞筠∞筠∞佰上山协５ｏ０＇２３４５６７８９１０ＴｉｍｅｓｏｆｉｏｎｓｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎＦｉｇ．４Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｉｏｎｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｓａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ２．３突变株Ｊ－Ｔ１８遗传稳定性研究为考察突变株遗传稳定性，进行连续五代培养，观察其产酶情况，从测定结果来看，Ｊ－Ｔ１８具有较好的遗传稳定性，其酶活大体维持在３８．２Ｕ／ｍＬ以上（Ｆｉｇ．５）。∞筠∞签∞幅竹５ｏ２３４ＧｅｎｅｒａｆｉｏｎｓＦｉｇ．５ＴｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎＪ－Ｔ１８２．４ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＪ－Ｔ１８的发酵时间曲线特性Ｆ№．６ｃ㈨ｏｆｔｈｅｆｅｍｌｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔａｎｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎＪ－Ｔ】８从图中可以看出，Ｊ－Ｔ１８菌株的菌丝体质量随着发酵时间的增加而增加，在７２ｈ达到最高点。Ｊ－Ｔ１８单宁酶活力在８０ｈ时达到最高点。总体来说单宁酶的产酶的曲线和菌丝体生长曲线在时间上是同步的。在发酵过程中ｐＨ值随着发酵时间的增加而逐渐降低，这主要是由于菌株逐渐利用了底物单宁酸而分解为没食子酸的缘故。但是由丁培养基中加入了ＣａＣ０３中和了酸性的降低，所以ｐＨ值的变化趋势相对比较稳定。２．５申宁酸浓度对中宁酶产量的影响为研究小嘲底物浓度刘产酶的影响，配制甲宁酸浓度分别为Ｏ２０％，２５％，３５％，１Ｏ％，１５％，Ｏ％的培养基，振荡培养３天后检测单宁酶的活力情况。由图７可以看出，单宁酸的含量在２０％时为最佳值，超过２０％，随着单宁酸含量的增加单宁酶菌株的产酶活性反而降低。单宁酶为诱导酶，过量反而会抑制卣株的生长，导致单宁酶产量的下降。产物口卧ｉ物都是酸性的，可能预示该菌株在低ｐＨ值时对底物有定的耐受｜生。虬，，∥ｉｊＦｉｇ．８Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｅ肿ｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ’ｓｖｏｌｕｍｅｏｎｔ卸ｎａｓ。ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ过少的装液量会使茼体的密度过高过甲的吸收和利用完发酵液中的活性物质．最终导致菌体产单宁酶的量下降。而过多的发酵液会导敛瓶中通氧的小足，影响到菌件对氧的利用，也会导致单宁酶发酵水、ｆ的下降。实验结果表明５０ｒａｌ为装液的最佳量。咀此为基础，进一步考察ｒ摇床转速对Ｊ－ｌ１８发酵产酶的影响。用转速分别为１２０、１４０、】６０、１８０、２００、２２０、２４０ｒｐｍ的摇床振荡培养单宁酶产生菌，８０ｈ后测定其酶的活力情况（Ｆｉｇ９）∞＊＃＊Ⅲ∞∞４Ｌ一一Ｆｉｇ．９ＥｆｆｅｃｔｏｆｒｏｔａｔｅｓｐｅｅｄＯｎｌａｎ…ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ从上图中可毗看出，在１８０ｒｐｍ的转速时，酶活力最大。ＩＪ见通气量对Ｊ—Ｔ１８菌株的影响还是比较显著的，我们选定装液量５０ｍｌ，摇床转述１８０ｒｐｍ作为它的堆适通气条件。２７接种量对单宁酶产量的影响片ｊ】Ｏｒａｌ的无茼水将斜而ｒ的孢子洗下，倒入盛有玻璃珠的二角瓶巾，振荡分散成为孢子悬液，其浓度约为２５×１０７个孢子／ｍｌ。分别接种ｌｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ于５０ｍｌ发酵培养基中，振荡培养８０ｈ后测定其晦的活力情况（Ｆｉｇ１０）。一般而言，接种量是影响菌株发酵周期的重婪因素．接种量越大，延滞期越短，反之越长。但是接利－量太大，则用于生长繁殖的营养成分消耗太多，产物的积累也可能会下降。通过实验发现，接种量为１ｍｌ时的菌株活力明显没有２ｒｎｌ高．但接种量为２ｍｌ～４ｍｌ时酶活力的影响相应改蹙并不大，所以为了节约葡种资源，选择２ｍｌ（即５ｘ１０个孢子）为最佳接种量。７，嚣疋；。姻同俐Ｍ幽网∽㈤幽冈㈥俐幽Ｆｉｇ１０Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍｓｉｚｅｏｎｔａｌｌｎａｓｃｐｍｄｕｃｌｉｏｎ２８发酵温度对单宁酶产量的影响温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物太分予的活性来影响微生物的生命活动。方而随着温度的列高，细胞内的酶反应速度加快，代谢和生长也相应加快；另一方面，随着温度进一步增高，生物活性物质（如蛋白质、核酸等）发生变化，细胞功能下降，甚争死亡。所以每种微生物都有个最适生长温度范围，为丫研究培养温度对黑曲霉Ｊ—Ｔ１８产单宁酶的影响，选取２８℃、３０℃、３２℃、３４℃四个小同的发酵温度对Ｊ—Ｔ１８进行发酵实验，８０ｈ后测定其酶活力的高低。结果表明，温度对菌株活性的影响比较大，在３０，一３２＂Ｃ时，菌株产单宁酶活性比较强，超过３２℃酶活力迅速下降ｆＦｉｇ１１）。Ｆｉｇ．１１Ｅｆｆｅｃｔｏｉｆｅｎｎｅｎｔａｔｉｅｎｔｅｍｐｅｒａｍｒｅｏｎｔａｎｔｌａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｅｎ２．９小同的金属离了和表面活陛剂对单宁酶产量的影响在培养基中分别加入０１％的金属离了Ｃ。。，Ｏ１％的表向活性剂：Ｔｒｉｔｏｎ、ＥＤＴＡＦｅ｝、Ｆｅ卜、Ｍｎ斗、Ｃｕ２＿、Ｚｎｌ＿、Ｓｎ｝、ｘｙｌｅｎｅ、ＳＤＳ，培养８０ｈ厉测定菌株单宁酶活性的高低。∞∞∞｛∞∞∞ｏ］同｜｜㈠¨｛｜｛｜｜｜｜ｌｊＬＩＵ，：ｉ上，Ｉ上＿＿Ｕ训塑巨团．．Ｋ｜罔网ｂ｜囫图幽同ｃｏｎ∞……ｅ…ｎ｝…ｚｎｎｓｎｎｃ０２＋ｒｒ］ＤｉＨｅｒｅＮＩ１０ｎｓＦｉｇ１２Ｅｆ／｝ｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｌｉｏｎｓｏｎｏｎ．＇ｍｅａｃｉｖｉｌ，～５０一Ｊ０ｌ三３。：｝２。ｉｉ１０Ｆｉｇ１３Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｌｅｒｅｎｔｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ。ｎｅｉｌｚｙｍｅａｃｔｉｖＪｔ）由以Ｊ：两图可以看出，金属禺予Ｍｎ２。、Ｓｎ２＋和表面活一Ｍ！卉ｌＪｘｖ】ｅｎｅ对苗株产酶的活｜生有较强的促进作用。而ＳＤＳ对菌株的产酶活性也宵一芷帕促进作川，但是没有Ｍｎ。、Ｓｎ一、ｘｙｌｅｎｅ强。其他离亍对苗株的产酶均有抑制作几］。３．结论低能离子束注入技术，作为一种创新的诱变方法，以其较高的突变率及较宽的突变谱等优点，在育种工作中正发挥越来越重要的作用。本研究以黑曲霉ＴＡ９７０１（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＴＡ９７０１）为出发菌株，研究了圹注入能量和剂量与存活率及突变率之间的关系，根据马鞍型存活曲线，得出了最佳诱变条件为：１０ｋｅＶ，３０ｘ２．６×１０玎＂－－＇６０×２．６ｘ１０１３ｉｏｎｓ／ｃｍ２，在此条件下对菌株进行了多次低能Ｎ＋注入，经过初筛和复筛，最终获得了高产菌株Ｊ．１８。随后对菌种的发酵条件进行了优化，通过对碳源，氮源，底物浓度，接种量，发酵时间温度以及通气量等因素的研究，最终确定了诱变后高产菌株的摇瓶发酵最佳条件：籼米粉５％、（ＮＨ４）２５０４１％、单宁酸２．Ｏ％、ＭｇＳ０４０．０３％、ＫＨ２Ｐ０４０．３％、ＣａＣ０３Ｏ．５％，最佳发酵时间为８０ｈ，摇床转速１８０ｒｐｍ，培养温度３０＊（２，接种量２ｍｌ，装液量５０ｍｌ／２５０ｍｌ，此时最高酶活为３８．５Ｕ／ｍｌ，较原始菌株提高了近４倍，并且在五代以内产酶稳定。金属离子Ｍｎｚ＋、Ｓｎ２＋与表面活性剂ｘｙｌｅｎｅ和ＳＤＳ对菌株产酶的活性有较强的促进作用。迄今为止，有关产单宁酶真菌菌株的改良还鲜有报道。而细菌中关于提高单宁酶产量的报道也主要是在地衣芽孢杆菌中。本研究是少数几个首先采用离子束注入诱变真菌的报道。突交后的改良菌株不仅可以稳定的产生高活力的单宁酶，而且具有较高的生物转化效率。因此，利用与开发突变株Ｊ．Ｔ１８将为大规模生产单宁酶及其它精细化工产品生产打下坚实基础，具有重要的产业化前景。参考文献１．Ｙｕａｎ，Ｃ．Ｌ．，ＷａｎｇＪ．，々＿眦Ｓ．ＧｏｎｇＧＨ，ＹａｏＪ．Ｍ．，ＹｕＺ．Ｌ．（２００２）ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｒａｃｈｉｄｏｎｉｃＡｃｉｄｂｙＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ１４９一Ｎ１８．ＦｏｏｄＴｅｃｈｎ０１．Ｂｉｏｔｅｃｔｍｏｌ，４０：３１１・３１５２．ＹｕＬ．，ＹｕＺ．Ｌ．（２００２）Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇｏｆ２一ｋｅｔｏ—Ｌ。ｇｌｕｏｎｉｃａｃｉｄｓｔｒａｉｎｓ．ＨｉｇｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１２（１１）：４１－４６３．ＷａｎｇＨ．Ｂ．，ＧａｏＸ．Ｗ．，ＧｕｏＪ．Ｈ．，ＨｕａｎｇＱ．Ｃ．，ＹｕＺ．Ｌ．（２００２）ＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＷａｔｅｒｍｅｌｏｎｗｉｔｈＰｕｍｐｋｉｎＤＮＡｂｙＬｏｗＥｎｅｒｇｙＩｏｎＢｅａｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰｌａｓｍａＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：ｔ５９１－１５９６４．余增亮，离子束生物技术引论，合ＪＪＥ：安徽科技出版社，１９９８Ｚ．Ｌ。（２０００）Ｉｏｎｂｅａｍａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ。ＩＥＥＥＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｏｎＰｌａｓｍａＳｃｉｅｎｃｅ２８：１２８—１３２徽农业科学，１９８９，２８：１２—１６Ｌ．Ｆ．．ＹｕＺ．Ｌ．（２００１）Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｏｗ—ｅｎｅｒｇｙｉｏｎｂｅａｍｏｎｗｈｅｍ．Ｒａｄｉａｔ５．Ｙｕ６．余增亮，何建军，邓建国，王学栋。吴跃进．刘贵付．离子注入水稻诱变育种机理初探．安７．ＷｕＥｎｖｉｒｏｎＢｉｏｐｈｙｓ，４０：５３－５７８．ＷｕＬ．Ｊ．，Ｒａｎｄｅｒ－ＰｅｈｒｓｏｎＱ，ＸｕＡ．，ＹｕＺ．Ｌ．（１９９９）Ｔａｒｇｅｔｅｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｗｉｔｈａｌｐｈａｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｄｕｃｅｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９６：４９５９—４９６４９．ＹｕＺ．Ｌ．，ＤｅｎｇＪ．Ｇ．，ＨｅＪ．Ｊ．（１９９１）Ｍｕｔａｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇｂｙｉｏｎｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｉｎｐｈｙｓｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂ５９／６０：７０５—７０８１０．Ｂｅｌｍａｒｅｓ，Ｒ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ—Ｅｓｑｕｉｖｅｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｒ．，Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ａ．，Ａｇｕｉｌａｒ，Ｃ．Ｎ．（２００４）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔａｎｎａｓｅ：ａｌｌｅｎｚｙｍｅｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔ．Ｗｉｓｓ．ｕｎｄ—Ｔｅｃｈｎ０１．，３７（８）：８５７－８６４１１．Ｃｏｇｇｏｎ，Ｐ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｎ．Ｈ．，＆Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，ＧＷ．（１９７５）．ＵＫＰａｔｅｎｔ１，３８０，１３５１２．Ａｇｕｉｌａｒ，Ｃ．Ｎ．，Ａｕｇｕｒ，Ｃ．，Ｆａｖｅｌａ・Ｔｏｒｔｅｓ，Ｅ．，Ｖｉｎｉｅｇｒａ－ＧｏｎｚＡｌｅｚ，Ｇ．（２００１）ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔａｎｎａｓｅｂｙＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＡａ－２０ｉｎｓｕｂｍｅｒｇｅｄａｎｄｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｔａｎｎｉｃａｃｉｄ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。２６（５）：２９６－３０２ａ１．Ｐ．Ｒ．Ｃ．Ｐａｔｅｎｔ（２０００）ＺＬ９３１０３３６１．６１３．ＹｕＺ．Ｌ．．ｅｔ１４．宋道军，姚建铭，邵春林，余增亮．离子注入微生物产生“马鞍型”存活曲线的可能作用机制．核技术，１９９９２２：１２９－１３２１５．ＬｉｂｕｃｈｉＳ．，ＭｉｎｏｄａＹ，ａｎｄＹａｍａｄａＫ．（１９６７）Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｕｓｉｎｇｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｕｉｔｒａｖｉｏｌｅｔａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ａｇｒ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．．３ｌ：５１３－５１８．１６．诸葛健，王正祥．工业微生物实验技术手册．中国轻工业出版社，１９９２．６３．离子束注入黑曲霉选育单宁酶高产菌株及其发酵工艺研究
作者：作者单位：
刘会， 郑之明， 贡国鸿， 聂光军
中国科学院离子束生物工程学重点实验室
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_7285221.aspx
