应用常压室温等离子体诱变技术选育非达霉素高产菌株
关亚鹏;张莉;米贯东;陈丽华;李晓露;娄忻;任风芝;张雪霞
【摘 要】Objective To obtain a fidaxomicin producing strain with high yields by mutation methods.Methods The primitive strain N12W-396 was treated by an atmospheric and room temperature plasma (ARTP) combined with the fidaxomicin self-resistance methodology.The production of fidaxomicin in shake flasks was chosen as the screening index.Results A high-yield mutant,designated as FD-13-194,was successfully selected.It exhibited good genetic stability and its
fermentation productivity was 42.9％ higher than the original strain in flask culture.In a 50L fermenter,the production of fidaxomicin reached
2612μtg/mL during the fermentation process at 208h.The study indicated that the optimal mutation time of ARTP was 300s and the minimal inhibitory concentration (MIC) of fidaxomicin was 1800μg/mL.Conclusion ARTP combined with the fidaxomicin self-resistance methodology is an effective approach to the screening of the fidaxomicin producing strain with high yields,the application of which will further improve the industrial production of fidaxomicin.%目的 通过菌种诱变方法筛选获得非达霉素高产菌株.方法 以非达霉素产生菌N12W-396作为出发菌株,采用新型常压室温等离子技术(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)结合非达霉素自身抗性处理诱变菌种,以摇瓶发酵液效价作为筛选指标.结果 与出发菌株相比,获得的高产突变株FD-13-194的摇瓶发酵能力提高了42.9％,且遗传性能稳定,在50L发酵罐中发酵208h非达霉素产量可达2612μg/mL.研究表明,ARTP最佳的照射时间为
300s,非达霉素抗性筛选的最小抑菌浓度(MIC)为1800μg/mL.结论 常压室温等离子体诱变技术能够有效的作用于非达霉素产生菌,结合其自身产物抗性筛选是获得高产菌株的良好手段,有利于提高非达霉素的工业生产水平. 【期刊名称】《中国抗生素杂志》 【年(卷),期】2017(042)008 【总页数】4页(P3-6)
【关键词】非达霉素;常压室温等离子体;自身抗性
【作 者】关亚鹏;张莉;米贯东;陈丽华;李晓露;娄忻;任风芝;张雪霞
【作者单位】微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015;微生物药物国家工程研究中心,河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015
【正文语种】中 文 【中图分类】R978.1
非达霉素(fidaxomicin)是一种新型的大环内酯类窄谱抗生素，主要通过抑制细菌的RNA聚合酶而产生迅速的抗艰难梭菌感染(CDI)作用，其治疗CDI的复发率和综合治愈率显著优于现有首选药物万古霉素和甲硝唑。且随着后两者药物耐药菌株的出现和逐渐增加，非达霉素成为治疗艰难梭菌感染的新选择，它具有延长抗生素后效应、治疗方案简单、交叉耐药性低和不良反应少等优点[1-3]。由Optimer制药有限公司开发的非达霉素(fidaxomicin/dificid)已于2011年4月获美国FDA批准上市，用于治疗艰难梭菌感染[4]。
常压室温等离子体(ARTP)技术是近年来刚刚兴起的菌种诱变育种技术，其原理是利用氦气作为工作气体的等离子体射流作用于微生物，从而引起微生物的突变。其优点是突变率高，容易获得遗传性能稳定的突变株以及过程安全、无毒等[5]。非达霉素主要是由指孢囊菌属或游动放线菌属的菌株发酵产生的[6]，目前有关非达霉素产生菌诱变育种方面的报道较少。本文通过常压室温等离子体技术复合非达霉素自身产物抗性筛选得到一株高产菌株，其发酵单位比出发菌株提高了42.9%，为大规模工业化生产打下良好基础。
游动放线菌(Actinoplanes sp.)N12W-396(本实验室保存)
分离培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、麦芽粉0.5%、琼脂1.6%。 种子培养基：淀粉2.0%、葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%。
发酵培养基：葡萄糖4.0%、黄豆饼粉1.5%、牛肉膏1.0%、氯化钠0.1%、七水硫酸镁0.01%。
ARTP诱变育种仪(ARTP-ⅡS无锡源清天木生物科技有限公司)
1.4.1 孢子悬液的制备
将出发菌种N12W-396的成熟斜面上加入适量无菌水，轻轻刮下孢子，倒入加有玻璃珠的摇瓶中振荡打散，过滤后制成孢子悬液，待用。 1.4.2 ARTP诱变
(1)样品处理参数 设置ARTP诱变育种仪的工作功率为120W，气流量10L/min，等离子体发射源与样品之间的照射距离为2mm。将照射时间设为0、120、180、240、300、360和420s。
(2)样品处理及洗脱 先将10μL制备好的孢子悬液均匀涂抹于无菌金属载片上，再将其依次放入样品载台的凹槽中。待全部照射完毕，将不同照射剂量的载片分别投入含有1mL无菌水的EP管中，于涡旋振荡器上振荡1min，把载片上经过ARTP处理过的孢子液洗下。 1.4.2.3 孢子液分离
处理后的孢子液经适当稀释，取100μL涂布于固体培养基上，28℃培养9～11d，菌落计数，以未经照射的孢子液作为对照，计算致死率。 致死率/%=(对照组活菌数-诱变组活菌数)/对照组活菌数 1.4.3 非达霉素最小抑菌浓度(MIC)的测定
制备一系列含不同浓度非达霉素的固体培养基，将孢子液稀释涂布其上，28℃培养9～11d。观察并记录菌落的生长状况，未长出菌落的最低浓度，即为非达霉素的MIC。
1.4.4 ARTP复合非达霉素自身抗性处理
将ARTP处理300s的孢子液稀释，涂布于含有一定浓度(1800μg/mL)非达霉素的固体培养基上。平板培养9～11d，挑选菌落转接斜面，再进行摇瓶初筛和复筛。 挑选长势良好的单菌落转接斜面，斜面培养成熟后挖块接种于种子培养基中，28℃、220r/min培养2d，再以5%的接种量接入发酵培养基中，28℃、
220r/min培养5～7d。发酵结束后测定发酵液菌丝体中产物含量。 以摇瓶单位超过对照菌株10%以上的菌株算作正突变株，计算正变率。 正突变率/%=非达霉素产量提高10%以上的突变菌株数/总诱变菌株数
取10mL发酵液，3000r/min离心10min，下层菌丝体体积占发酵液总体积的百分比即为菌体生长量(packed mycelial volume, pmv, %)。 1.7.1 发酵样品处理
取一定量的发酵液置于离心管中，3000r/min离心10min，弃去上清，菌丝沉淀加入无水乙醇至原体积。菌丝与乙醇充分混匀后，浸泡30min，再次离心，取上清液进行HPLC检测，即为样品中胞内产物含量。 1.7.2 效价测定
采用HPLC方法[7]，色谱柱：Extend C18(4.6mm× 250mm, 5μm)；流动相：乙腈-0.5‰乙酸水 (58:42)；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；进样量：10μL。
出发菌株N12W-396经ARTP不同剂量的照射处理，根据菌落计数和摇瓶筛选结果，统计出每个照射剂量下的致死率和正突变率(图1)。
由图1可见，当ARTP诱变剂量为420s时，孢子的死亡率接近于100%，而诱变时间为300s时菌株的正突变率最大为32.3%，致死率为92.7%，所以选定诱变时间300s作为ARTP最佳的照射剂量。
将出发菌株N12W-396的孢子悬液，涂布在含非达霉素浓度分别为1000、1200、1400、1600、1800和2000μg/mL的固体培养基上，观察并记录菌落生长状况，结果见表1，同时计算不同非达霉素浓度的致死率，结果见图2。
与不加非达霉素的培养基相比，加有非达霉素的培养基菌落生长明显缓慢，且菌落相对较小，随着非达霉素浓度的增加，平板上生长出的菌落数也越来越少，当非达霉素浓度为1800μg/mL时，平板上已经没有菌落长出，所以确定非达霉素对出发
菌株的MIC为1800μg/mL，抗性筛选剂量亦为1800μg/mL。
将出发菌株N12W-396斜面制得的孢子悬液，经ARTP诱变处理300s后涂布于含非达霉素浓度为1800μg/mL的固体培养基上，28℃培养10～11d，挑选203个抗性菌落传斜面培养。再经两级摇瓶发酵培养，测定发酵液中产物含量。在所有挑选的抗性菌落有92株产物产量高于出发菌株，从中挑选发酵能力提高10%以上的20株高产菌株进行3批的摇瓶复筛，如图2所示。在这些突变株中，得到一株产非达霉素能力最高的菌株FD-13-194，其发酵水平比出发菌株N12W-396提高了42.9%。
将高产菌株FD-13-194连续传代4次，5代斜面同时进行摇瓶发酵培养，以验证其传代稳定性，结果见表2。
从结果可以看出，突变株FD-13-194从F1到F5代一直保持比较稳定的发酵水平，说明该菌株具有良好的遗传稳定性，适用于工业生产。
将高产菌株FD-13-194的成熟斜面接入摇瓶种子培养基中，培养2d，再接入50L发酵罐中进行培养。分别于16、40、、88、112、136、160、184、208和232h取发酵液，监测其在发酵过程中pH、菌体生长量及非达霉素产量的变化趋势。
由图3可以看出，在整个发酵过程中，突变株FD-13-194先经历了短暂的停滞期，大约在16h后，菌丝体进入了快速生长期，效价涨幅也逐渐增大，发酵至208h时，效价最高达到2612μg/mL，整个过程中pH变化也比较合理，所以FD-13-194是理想的突变株。
非达霉素作为治疗及预防CDI复发的替代治疗新药，具有很大的应用前景。但目前仍处于实验室向工业化生产的转化阶段，亟需筛选到生产性能稳定的高产菌株。 本研究利用ARTP诱变技术结合非达霉素自身产物抗性筛选对出发菌株进行处理，ARTP技术显示了良好的诱变效果，当照射时间为300s时正突变率达到32.3%，
结合非达霉素的MIC(1800μg/mL)自身产物抗性筛选，获得一株高产突变株其摇瓶发酵水平比出发菌株提高了42.9%，且连续传代五代遗传特性稳定，在50L发酵罐中培养208h发酵效价可达到2612μg/mL，为大规模工业化生产打下基础。自身次级代谢产物的抗性筛选是选育高产菌株的方法之一，其原理是通过提高产生菌对自身产物的耐受性以解除或减轻自身产物对生物合成的反馈调节作用来达到提高产物发酵水平的目的，高产菌株对次级代谢产物的耐受能力往往大于低产菌株，刘朋等[8]就曾利用此方法筛选到了比对照菌株提高38%的盐霉素突变株。本研究表明，自身产物抗性筛选对于非达霉素产生菌同样是可行的。
【相关文献】
[1] Crook D W, Walker A S, Kean Y, et al. Fidaxomicin versus vancomycin for clostridium difficile infection: meta-analysis of pivotal randomized controlled trials[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(2): s93-s103.
[2] Hardesty J S, Juang P. Fidaxomicin: a macrocyclic antibiotic for the treatment of clostridium difficile infection[J]. Pharmacotherapy, 2011, 31(9): 877-886.
[3] 姜春梅, 刘洋, 王京晶, 等. 抗感染新药非达霉素的药理作用与临床评价[J]. 中国新药杂志, 2011, 20(3): 2283-2285.
[4] 马培奇. 美FDA咨询委员会推荐批准非达霉素治疗艰难梭菌感染[J]. 上海医药, 2011, 32(5): 235.
[5] 金玮玥, 宋明凯, 矫文豪, 等. 常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其性质研究[J]. 生物技术通报, 2015, 31(12): 249-255.
[6] 华北制药集团新药研究开发有限责任公司. 一种游动放线菌菌株及其在制备非达霉素中的应用: CN, 103320355B[P]. 2013-09-25.
[7] 高月麒, 李晓露, 王海燕, 等. 树脂吸附法分离纯化非达霉素的研究[J]. 中国抗生素杂志, 2015, 40(3): 183-185.
[8] 刘朋, 杭海峰, 储消和, 等. 盐霉素自身抗性高产突变菌株筛选[J]. 中国抗生素杂志, 2012, 37(2): 101-104.
