普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析

普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析

胡军华1,2，王大伟1，杨明磊1,2，王 新1,2，吴新儒1，吴 华1，刘贯山1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，

北京 100081）

摘 要：DREB转录因子含有一个保守的AP2/ERF结构域，在植物抗逆过程中起关键作用。利用生物信息学分析手段，以拟南芥DREB家族成员序列为参照，在普通烟草（Nicotiana tabacum）基因组公共数据库中鉴定出了68个DREB转录因子。对烟草DREB转录因子家族进行了理化性质、系统进化、保守结构域和表达分析。结果表明，普通烟草基因组编码68个DREB转录因子家族成员，氨基酸数目差异较大；系统发育分析表明，拟南芥和烟草的DREB转录因子共125个成员形成6个进化分支，其中烟草比拟南芥缺少A6分支；结构域分析表明，同一分支内的DREB转录因子的保守结构域以及motif具有高度的一致性；组织表达分析表明，大多数DREB家族基因在烟草中表达量较低，在衰老、干旱和病害胁迫下基因表达量较多。此研究将为烟草DREB转录因子的深入分析奠定了生物信息学基础。 关键词：DREB转录因子；普通烟草；生物信息学；表达分析

中图分类号：S572.03 文章编号：1007-5119（2017）01-0001-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.001

Genome-wide Sequence Identification and Expression Analysis of DREB

Transcription Factors in Nicotiana tabacum

HU Junhua1,2, WANG Dawei1, YANG Minglei1,2, WANG Xin1,2, WU Xinru1, WU Hua1, LIU Guanshan1*

(1. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao

266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: DREB transcription factors, with a typical AP2/ERF DNA-binding domain, play a key role in plantsʼ tolerance to environmental stresses. In this study, based on the common tobacco genome database, 68 members of the tobacco DREB gene family were identified according to Arabidopsis thaliana protein sequences. The analyses of physical and chemical properties, phylogenetic tree, gene structures, and tissue expression patterns were performed. The results suggested that the peptide length of different subfamily members was significantly different. Phylogenetic analysis revealed that the tobacco DREB transcription factor family members could be divided into 5 subfamilies, lacking the A6 group from Arabidopsis thaliana. The patterns of protein structures and organization of conserved domains in tobacco were highly conserved within subfamilies based on the phylogenetic results. Transcriptome analysis showed that the expression patterns of DREBs were different in different tissue types and most DREBs have low expression levels in tobacco, although some have higher expression levels after environmental stress treatments. These results provide a very useful reference for cloning and functional analysis of DREB genes in tobacco.

Keywords: DREB transcription factor; Nicotiana tabacum; bioinformatics; expression analysis

DREB（dehydration responsive element binding protein）转录因子，即干旱应答元件结合蛋白，含有一个保守的AP2/ERF结构域[1]。AP2/ERF结构域由60个左右的氨基酸残基组成，可形成3个反向平行的β-折叠和1个α-螺旋结构。其中第14位的

缬氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E)非常保守，在DREB转录因子与DRE/CRT(dehydration responsive element /C-repeat )顺式作用元件特异性结合中起关键作用[2]。DREB转录因子由逆境胁迫诱导产生，结合DRE/CRT顺式作用元件，激活下游许多抗逆

基金项目：国家烟草专卖局烟草基因组计划重大专项“烟草高香气、抗青枯病、抗TMV突变体鉴定及中烟100、翠碧一号品种定向改良”

[110201301005(JY-05)]

作者简介：胡军华（1990-），在读硕士，专业方向：烟草突变体鉴定与利用。E-mail：1577209402@qq.com。*通信作者，E-mail：liuguanshan2002@163.com 收稿日期：2016-07-04 修回日期：2016-08-15

2 中国烟草科学 2017年第38卷

相关功能基因的表达。因此，利用DREB转录因子来增强植物的抗逆性成为改良植物抗逆性的重要手段，已成为植物分子生物学研究的热点之一[3]。

第1个DREB家族基因CBF1（CRT-binding factor1）是利用酵母一元杂交方法从拟南芥cDNA文库中克隆得到的[4]。迄今在拟南芥鉴定了57

个DREB转录因子，可分为6个亚家族（A1-A6）

[5]。在正常生长条件下，拟南芥中几乎检测不到DREB转录因子的表达。低温能诱导A1和A4组成员表达；A2和A3组成员受干旱和高温诱导表达；A5成员可能负反馈于A1和A2组；A6组成员的表达也受胁迫诱导，下游基因可能不同于其他组成员[6]。

烟草作为一种重要的经济作物和典型的模式植物，也进行了一系列其他物种DREB转录因子的转基因生物学功能分析，获得许多抗逆性强的转基因烟草植株，鉴定了若干物种DREB转录因子的功能。例如，参与抗干旱的BnDREB1-5基因[7]，抗低温、干旱的AtDREB1A基因[8]，抗高离子、高渗透胁迫的PgDREB2A基因[9]等。普通烟草基因组测序的完成为烟草功能基因组学研究提供了重要的序列信息[10]，烟草中许多基因家族被相继鉴定并完成了相关生物信息分析，如MATE

转录因子家族[11]、

SBP转录因子家族[12]等。然而，目前在全基因组水平上研究普通烟草DREB转录因子尚未有报道。本研究采用生物信息学方法对其基因家族各成员的物理化学性质、进化关系、保守结构域、三维结构、表达情况等进行分析，对进一步研究其在烟草生长发育及抗逆响应中的功能具有重要意义，也为进一步研究DREB转录因子成员的生物学功能奠定了基础[13]。

1 材料与方法

1.1 普通烟草DREB转录因子蛋白质序列的鉴定及理化性质分析

根据文献资料报导，从TAIR数据库（http:// www.arabidopsis.org/）中搜索下载拟南芥DREB转录因子家族蛋白全长序列，利用HMMER软件构建HMM模型，在烟草公共数据库（http://solgenomics.

net/）中进行检索，获得候选的烟草蛋白质序列，然后将序列在SMART（http://smart.embl-heidelberg. de/）中进行蛋白质结构域分析[14]，以及在烟草公共数据库中检索比对，剔除ERF亚家族的序列，删除重复序列，最终筛选出普通烟草DREB转录因子蛋白序列。利用ExPASy服务器上的ProtParam在线工具，对预测的烟草DREB转录因子成员进行氨基酸数目、等电点、分子量等理化性质分析。利用TargetP在线工具对各个转录因子进行亚细胞定位分析[15]。

1.2 烟草和拟南芥DREB转录因子系统进化树的构建

利用MUSCLE软件对拟南芥和普通烟草DREB转录因子蛋白序列进行比对，参数选为默认值。将多序列比对结果利用MEGA7软件采用邻接法（NJ，neighbor-joining）构建DREB转录因子的系统进化树，校验参数Bootstrap设置为1000次，根据进化树将家族成员重新命名[16]，并利用EvolView显示系统发生树。

1.3 普通烟草DREB转录因子motif搜索分析

利用MEME进行蛋白序列的motif搜索[17]，标出保守氨基酸。在SWISS-MODEL（http:// swissmod el.expasy.org/interactive）网站上查找三维结构模板，选择最适三维结构模板，使用Pymol软件标出保守结构域[18]。

1.4 普通烟草DREB转录因子的表达分析

NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中下载烟草转录组测序数据，利用R语言Bioconductor程序对转录组数据进行分析并提取DREB家族转录组数据。将数据均一化后，使用MeV（MultiExperiment Viewer）软件绘制热图。

2 结 果

2.1 普通烟草DREB转录因子家族成员鉴定及理化性质分析

利用57条拟南芥DREB转录因子蛋白序列，在普通烟草基因组公共数据库鉴定出6烟

第1期 胡军华等：普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析 3

草DREB转录因子蛋白序列。把新鉴定的烟草DREB蛋白序列与拟南芥序列一起构建邻接树，根据它们在进化树上的排列顺序，将普通烟草68个成员重新命名为NtDREB1到NtDREB68（图1），并利用ProtParam在线工具进行了理化性质分析。结果表明，烟草DREB转录因子氨基酸数目差异较大，在120~472 aa，而同一亚家族之间变化较小。理论等电点从4.48到9.85之间，其中A1、A2和A4亚家族等电点7以下居多，富含酸性氨基酸；而A3和A5亚家族理论等电点7以上较多，富含碱性氨基酸。从转录因子不稳定指数来看，大多数大于40，是不稳定的，只有11个数值低于40，表现为稳定。TargetP亚细胞定位显示，大部分转录因子是其他类型蛋白，21个为叶绿体转运肽，只有NtDREB35为线粒体导肽（表1）。

2.2 普通烟草DREB转录因子家族系统进化树的构建

为了揭示烟草DREB转录因子家族的进化关系，

以拟南芥DREB转录因子家族成员为参考，对新鉴定的烟草DREB成员进行MUSCLE多序列比对和进化树的构建（图1）。拟南芥进化树分支与前人研究结果一致，57个成员可分为6个亚家族，A1、A2、A3、A4、A5和A6[5]，数量分别为6、8、1、17、15和10个。与拟南芥的6个亚家族相对应，可将烟草的68个成员分为5个亚家族，A1、A2、A3、A4和A5，数量分别为22、16、2、20和8个，缺少A6分支。从图1可以看出，整个进化树还可以分为两个关系紧密的大组，其中A1、A4和A5为一组，A2、A3和A6为另一组。

表1 普通烟草DREB转录因子的理化分析

Table 1 Characteristic analysis of the DREB transcription

factors in N. tabacum

亚家族 个数 氨基酸数目 理论等电点 不稳定指数 ≥7

亚细胞定位

<7 ≥40 ＜40 cTP mTP other

A1 22 120~251 4 18 20 2 10 0 12 A2 16 194~472 1 15 9 7 1 0 15 A3 2 324~330 2 0 2 0 2 0 0 A4 20 154~300 3 17 20 0 8 1 11 A5 8 145~354 7 1 6 2 0 0 8 注：cTP 叶绿体定位；mTP 线粒体定位；Other 不存在定位信号。

注：系统进化树采用邻接法，利用MEGA7.0 构建，Bootstrap 检验次数设为1000次。

图1 普通烟草与拟南芥DREB转录因子的系统进化树

Fig. 1 A phylogenetic tree of DREB transcription factors in N. tabacum and Arabidopsis

4 中国烟草科学 2017年第38卷

2.3 普通烟草DREB转录因子motif搜索及保守序列分析

利用MEME对DREB蛋白质全长序列进行motif搜索，共鉴定得到6个motif。除了NtDREB5，剩下所有转录因子成员蛋白质序列均含有motif1和motif2。同一亚家族内的DREB转录因子成员motif的种类、数目和分布都有高度一致性，这同样反映了进化树的可靠性。A1和A4亚家族还含有motif3，而且对应位置相似，都在motif2后面。A1亚家族尾部还特含有motif4，头部还特含有motif5。A2亚家族还特含有motif6（图2）。

注：左边系统进化树利用MEGA7.0邻接法构建，右边是利用

MEME进行motif搜索得到6个motif的分布图。

图2 普通烟草DREB转录因子进化树motif分布 Fig. 2 Phylogenetic trees，motif distribution of DREB

transcription factors in N. tabacum

为进一步分析烟草DREB转录因子motif的保守性，利用MEME得到6个motif的保守序列（图3）。保守序列motif1和motif2分布最广泛，在DREB转录因子家族中保守性最高，分别有22个和41个保守氨基酸，共同组成了AP2/ERF结构域。motif1的第16位和第21位对应的是AP2/ERF结构域的第14位的缬氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E)，这是DREB与ERF家族的主要区别。另外还搜索到有4个保守序列，分别为motif3、motif4、motif5和motif6，分布于不同的亚家族，也具有较高保守性。基于Swiss-Model平台对DREB同源异型结构域进行同源建模，三维结构显示出AP2/ERF结构域的典型特征：3个β-折叠和1个α-螺旋，且motif1形成2个β-折叠结构，motif2形成1个β-折叠和1个α-螺旋结构。

注：利用MEME在线工具分析得到6个motif的保守序列，不同字母代表各种氨基酸的简称，字母高度越高代表氨基酸在该位点的保

守性越强。

图3 普通烟草DREB转录因子的motif分析 Fig. 3 Motif analysis of DREB transcription factors in N.

tabacum

第1期 胡军华等：普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析 5

2.4 普通烟草DREB转录因子基因家族的组织表达分析

利用MeV软件将普通烟草DREB的转录组数据绘制热图（图4）。由图4可以看出，绝大多数烟草DREB基因表达量没有或很少，且有24个基因未检测到表达。A1和A4组在叶低温处理（D8）组表达量较高，A2和A3组在整株干旱处理（D9）表达较高，这与拟南芥的一致。在种子中表达的有11个；打顶后茎中表达的有12个；有15个在愈伤组织中表达；有17个在花芽中表达；根在幼

苗期和打顶后分别有13个和17个表达；叶片中在幼苗期和打顶后分别有10个和13个表达。通过低温、干旱和接菌处理后，分别有18、22和20个表达基因，明显比其他正常生长植株基因表达数量多。其中A5组的NtDREB45和A2组的NtDREB63两个基因在各个组织中表达量都较高。比较观察干旱处理和黑胫病处理后基因的表达情况发现，在干旱中表达的基因也会在黑胫病处理后表达，且表达量的高低也相似，两者有很强的相似性。

注：D0种子；D1茎打顶后；D2愈伤组织；D3花芽；D4根幼苗期；D5根打顶后；D6叶幼苗期；D7叶打顶后；D8叶低温处理；D9整株干旱处理；D10茎黒胫病接种。系统进化树采用邻接法构建，颜色越深，表达量越高，颜色越浅，表达量越低，白色表示没有相关数据。

图4 普通烟草DREB基因表达模式热图

Fig. 4 Expression patterns of the DREB transcription factor genes in N. tabacum

6 中国烟草科学 2017年第38卷

3 讨 论

本研究利用生物信息学方法，从普通烟草数据库中分离鉴定了68个DREB转录因子，理化分析表明，各成员之间氨基酸数目变化差异较大，A1、A2和A4亚家族富含酸性氨基酸，A3和A5亚家族富含碱性氨基酸。将它们与拟南芥一起构建系统进化树，与拟南芥相比，烟草各亚家族数量发生了变化，烟草家族成员数量约为拟南芥数量的两倍，但在不同亚家族中数量倍数差别很大，且缺少A6分支，说明在拟南芥和烟草分化以后，DREB各亚家族可能又各自发生了不同的进化事件，而且最终导致普通烟草在A6分支上的缺失。motif搜索到6个保守性较高的蛋白序列，同一亚家族成员之间motif在结构、数量和分布上具有相似性，不同亚家族之间呈现差异，从而导致不同亚家族发挥不同功能，这也从侧面验证了进化树的可靠性。与拟南芥研究一致，A1与A4之间motif相似程度高，它们在进化树分布上也很靠近。A2和A3之间motif相似程度高，与在进化树上分布一致。

DREB转录因子组织表达分析表明，总体上表达量均较低，有24个成员未表达，这可能是因为它们不参与这些环境胁迫，或表达量很低检测不到。打顶后的老叶和老根中表达量比幼根和幼叶多，干旱、低温和病害处理后，表达量会有一定升高，这反应了DREB转录因子作为抗逆相关蛋白，在逆境胁迫下促进其表达。与拟南芥相同，A1和A4组受低温诱导后表达的数量较多；A2和A3组受干旱诱导后表达的数量较多。比较在茎黑胫病处理和干旱处理中的表达，两者有很强的相似性，猜测DREB家族在对黑胫病的反应和对干旱的反应可能使用相同应答机制，但具体功能机制有待于利用分子生物学等手段进行进一步的基因功能验证。A5组的NtDREB45和A2组的NtDREB63表达量一直较高，猜测它们可能与烟草生长发育相关，而与抗逆不太相关，但这要做进一步的生物学试验分析。

4 结 论

本研究利用普通烟草基因组数据，通过生物信息学方法鉴定了普通烟草基因组编码的68个DREB转录因子家族成员，并将这些成员分为5个亚家族。同一亚家族内DREB转录因子的保守结构域以及motif具有高度的一致性。组织表达分析表明，与拟南芥研究结果相似，大多数DREB家族成员在烟草中表达量较低，在衰老、干旱和病害胁迫下基因表达量较多。

本研究通过生物信息学手段对烟草中DREB转录因子的分离鉴定和生物信息学分析，为培育抗逆转基因烟草奠定了初步的基础，也为烟草逆境生理研究和烟草DREB转录因子研究提供参考，但其具体的机制以及的下游基因，还需要通过进一步试验进行分析验证。

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《烟草科技》2017年第1期目次

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析…………………….……….……….….…….……李 锋，孟利军，史艳梅，等 1 烤烟和白肋烟烟苗氮代谢的差异分析……………………….………………………….…….……李亚飞，常 栋，孙军伟，等 6 试验土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测分析………………………….….…….……………程 承，李石力，刘 颖，等 12 津巴布韦烤烟杂交种的利用与启示……………………….……………………………………………………曹景林，余 君 17 运用模糊矩阵预测延安地区烟草生长期烟粉虱的发生量…………………….…….…….….………徐世才，陈邦凯，陈雅梅 25 二氯甲烷提取物致香成分GC/MS指纹图谱在烤烟香型鉴别中的应用…………….…….……许洪庆，吕大树，张亚恒，等 30 卷烟主流烟气烟熏香成分的感官导向分析……………….…………………………………..……朱 浩，柴国璧，迟广俊，等 41 微透析-HPLC-ECD联用在线测定烟碱暴露大鼠脑内单胺神经递质的动态变化……………………徐 妍，毛 健，庆 宏 50 分散液液微萃取-GC-MS/MS法测定卷烟主流烟气粒相物中的农药残留……….……….……陈晓水，杨 洋，汤晓东，等 58 基于视觉形态特征检测的烟梗切丝质量分析……………….…….……….…….……….…….…张超凡，董 浩，刘 勇，等 67 叶丝加料和片烟加料对一、二、三类卷烟感官质量的影响…….…….…………………….……孙志涛，魏明杰，王 东，等 74 基于多元分析法的卷烟物理指标综合测试系统的能力评价…………………………………….……施亮星，邢 波，范胜兴 80 基于伺服精密驱动的滤棒装盒控制系统……………….…………………….……………….……倪 敏，堵 俊，吴 晓，等 87 YB618型硬条提升及条外透明纸美容装置的改进…….………………………….…….….……马万杰，施忠兵，张志盛，等 92