葛根总黄酮提取方法与纯化工艺的研究
黄酮类化合物传统的提取方法有煎煮法、浸渍法、渗辘法、回流提取法、索氏提取法等，这些方法普遍存在着活性成分提取率不高，杂质清除率低，能耗高周期长等许多缺点。随着技术的进步，近年来在提取工艺方面引入了一些新技术、新方法，如超临界流体萃取法、超声提取法、酶法提取、微波提取法、荷电提取法、半仿生提取法等。
葛根，是豆科植物野葛，为中国南方一些省区的一种常食蔬菜，其味甘凉可口。主要成分是淀粉，还含有约12％的黄酮类化合物，包括大豆甙、大豆甙元、葛根素等10多种；同时含有胡萝卜甙、氨基酸、香豆素类等。因此，葛根可作为药物应用。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、抗氧化、抗衰老、抗辐射、保护血管、防止动脉硬化、提高机体抗氧化能力及对NO的降解、明显扩张微细血管、降低血管阻力、增加脑血
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流量、改善微循环、清除自由基等作用。葛根总黄酮可以提高机体内超氧化物歧化酶(SOD)
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的活性,加速对体内自由基的清除。
由此可见，葛根总黄酮具有极高的药用价值，且在云南分布广泛。因此以葛根为例，通过对近几年有关葛根总黄酮提取文献的研究，我对其部分提取方法和纯化工艺进行了总结。
1 提取方法
葛根总黄酮的提取方法主要包括传统的溶剂提取法和比较新的物理场强化提取方法，以下对其分别进行了较为详细的介绍。 1.1 浸提法
浸提也是萃取的一种，是利用相似相溶原理，通过系统中不同组分在溶剂中有不同的溶解度来分离葛根混合物的操作。浸提法也就是固液萃取法，是将葛根样品浸泡在溶剂中，将固体样品中的总黄酮浸提出来的方法。该法不需加热，适用于对热不稳定的成分，但提取效率低，且水提液容易霉变。
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张喜梅等采用传统的浸提法，以乙醇为溶剂，考察了溶剂体积分数、提取时间、固液比、提取温度和葛根粉粒度对葛根总黄酮提取率的影响，并在单因素实验的基础上，通过正交试验，确定了葛根总黄酮的提取工艺。结果表明，提取温度、提取时间、固液比、乙醇体积分数以及粒度对葛根总黄酮的提取率均有影响，优化的葛根总黄酮的提取工艺为：提取温度为80℃，提取时间为120 min，乙醇体积分数为70%，固液比为1:12，粒度为80目。 1.2 乙醇回流法
回流提取法需要加热，因而适用于对热稳定的成分，提取效率高，但溶剂消耗量大。然而，连续回流提取法（使用索氏抽提器）可以节省溶剂，但提取时间较长。
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刘晓宇等 通过乙醇加热回流法得到了葛根黄酮提取物。该提取工艺的最佳条件为：70%(V/V)的乙醇水溶液作为溶剂，固液比为1:30(m/V)、浸提时间为1h、浸提温度为80℃。，经验证总黄酮含量为12.05%，这与实际葛根中黄酮类化合物含量很接近。 1.3 超声提取法
超声提取法是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸提方法。该法提取温度低、提取率高、提取时间短。是替代传统工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。
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程亮光等以乙醇为溶剂,研究了预浸时间、超声功率、超声作用时间以及占空比对葛根总黄酮提取率的影响,结果表明：预浸时间为10min,超声功率为300W,超声作用时间为20min,占空比为1时,所得到总黄酮的提取率最大。
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1.4 酶解法
酶解法与溶剂提取法相比，具有绿色环保、后处理简单等优点，但人们对酶解法的提取工艺条件还未见很深入的探讨。
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汤海鸥等以产高活性纤维素酶、果胶酶、蛋白酶的黑曲霉ANO2鲜曲对葛根进行酶解处理,然后对葛根进行常规提取,测定其有效成分黄酮的提取量,并与未加黑曲霉组进行了对比分析。结果表明:葛根黄酮的提取量提高21.1%,经t检验分析,加黑曲霉前后提取量均数差异极显著(P<0.01)。对酶解条件进行了优化,确定黑曲霉酶解法提取葛根的最佳条件为:最佳温度40℃、pH值4.0、酶解作用时间6 h、加黑曲霉量为6%。研究表明,在最佳酶解条件下,黑曲霉ANO2鲜曲能显著提高葛根有效成分的释放提取。 1.5 水提取法
水提取法，顾名思义，就是以水为提取溶剂。因为水的来源广泛，而且价格便宜，所以该工艺操作简便易行，适用于大规模生产。
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李旭洲等以葛根素得率和葛根总黄酮得率为指标，采用正交试验法优选葛根水提工艺，结果表明：葛根的最佳水提工艺为9倍量水提取3次，每次90 min,葛根总黄酮和葛根素提取率分别为92. 17%和84. 91 %。既保证了提取率，又降低了生产成本。 1.6 微波提取法
微波提取技术与现有其他的提取技术相比有明显的优势。化学溶剂提取法耗能大、耗材多，耗时长，提取效率低，工业污染量大。超临界流体提取在提取效率上得到大大提高，但其方法要求的装备复杂，溶剂选择范围窄，需高压力容器和高压泵，故投资成本较高，建立大规模提取生产线有工程难度。
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白兰莉等 采用微波辅助浸取新工艺从葛根中提取总黄酮.通过单因素和正交实验相结合的方法,研究了新工艺的实验条件.结果表明:在常压下,当微波功率为700W,葛根粒度为80目, 预泡1h, 固液比为1：25,乙醇溶剂浓度为60%,微波辐射40 s,间歇辐射3次,可得到最佳提取率83.92%,比传统回流浸取和超声浸取葛根总黄酮工艺具有快速、节能和浸取率高等优点。
2 纯化工艺
通过对近几年有关文献的查阅，发现葛根总黄酮的分离纯化主要是通过大孔吸附树脂来实现。大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂 ,具有选择性好、吸附容量大、解吸容易、再生简便等优点 ,应用于葛根总黄酮的富集纯化有较好的效果。以下就对几种典型的大孔吸附树脂进行介绍。
2.1 D101型大孔吸附树脂
D10 1型树脂是一种非极性的大孔吸附树脂。
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安彩贤等研究了D10 1型大孔吸附树脂分离纯化葛根中总黄酮的工艺条件，结果表明：D101型树脂对混合物中总黄酮有良好的吸附,其吸附分离的工艺条件为葛根黄酮饱和吸附量10.10mg·g-1,吸附流速3mL·min-1,洗脱剂为80%乙醇,洗脱剂用量为20倍药材量,洗脱流速3mL·min-1。因而，得出结论:D101大孔吸附树脂可用作葛根中总黄酮的精制。 2.2 AB-8型大孔吸附树脂
AB-8型大孔吸附树脂是苯乙烯型弱极性共聚体，最适宜水溶性、具有弱极性物质的提取、分离、纯化。
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陈最鹏等研究了AB-孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺条件。以葛根素、葛根总黄酮为指标,对上样相对质量浓度、流速、上样量、水洗脱用量、乙醇洗脱浓度、乙醇用量及树脂再生前使用次数进行考察。结果表明：上样相对质量浓度: 0. 20 g·mL-1,流速: 3 BV·h-1,上样量: 2. 5 BV,水洗脱用量: 2 . 0 BV,乙醇洗脱浓度: 70%,乙醇用量: 2. 5 BV,
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树脂再生前可使用3次。总黄酮和葛根素的纯度分别可达65%和27%。因此，AB-孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺条件可用于葛根中总黄酮的精制。 2.3 SP70型大孔吸附树脂
SP70型大孔吸附树脂属于聚苯乙烯系列合成树脂。
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刘火安等 采用静态与动态的吸附-解吸两种方法,利用紫外可见分光光度计测量葛根总黄酮的含量,研究不同大孔吸附树脂及其不同的工艺条件对总黄酮分离纯化的影响。结果表明 ：SP70分离效果最好,其最佳工艺为药液浓度0.5 g·mL-1(相当于原生药)、pH为5 -6、以2 BV·h-1速率进行上样,上样量为60 BV,以5 BV的70%乙醇、2 BV·h-1的流速进行洗脱,效果最佳。经SP70处理后的葛根总黄酮的含量可达80%以上。结论是大孔吸附树脂SP70分离纯化总黄酮效果较好,适合工业生产。 2.4 HPD300型大孔吸附树脂
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HPD300型大孔吸附树脂的树脂骨架是苯乙烯，比表面积为650m/g,孔径是27，属于非极性的大孔吸附树脂。
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陈幸苗等以葛根总黄酮和葛根素为指标,对萃取法、盐析法、活性炭吸附法以及大孔树脂吸附法四种纯化方法进行综合评价,并对大孔树脂吸附法进行了工艺优化。结果表明：四种纯化方法中,大孔树脂吸附法效果最佳。非极性大孔树脂更加有利于葛根总黄酮及葛根素的纯化,且以HPD300最佳。其中，HPD300树脂吸附纯化时,以上样液浓度1g·mL-1(相当于原生药),20%乙醇洗脱效果最佳,其中葛根总黄酮可达90%以上,葛根素纯度可达50%以上,能满足大工业生产的要求。 2.5 HPD750型大孔吸附树脂
HPD750型大孔吸附树脂是中极性的，外观呈乳白色不透明球体，颗粒尺度是20目-60目。
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李旭洲等以葛根素得率和葛根总黄酮得率为指标，采用正交试验法优选葛根水提工艺，单因素考察优选葛根水提液的大孔树脂纯化工艺。结果表明：葛根的最佳水提工艺为9倍量水提取3次，每次90 min,葛根总黄酮和葛根素提取率分别为92. 17%和84. 91 % a葛根水提液的最佳大孔树脂富集工艺为:HPD-750大孔树脂，径高比1:6，上样液浓度1.5梦mL，最大上样量3 BV，上样流速1 mlJmin，洗脱剂70%乙醇，洗脱剂用量5 BV。葛根水提液经大孔树脂纯化后的出膏率为4. 47 %，纯化物中葛根总黄酮和葛根素的含量分别为76.22%和56. 20%。该工艺操作简便易行，适用于大规模生产。
3 总结
综上，我们虽然只是以葛根为例对其总黄酮的提取及纯化进行了研究，但是这些提取及纯化方法也适用于其他多种植物。当然，其中还有许多不完善的地方，我会在今后的学习及实验中对这一部分理论知识进行升华。
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