二甲双胍对脑出血模型小鼠血肿周围脑组织炎症反应的影响

485

实验研究二甲双胍对脑出血模型小鼠血肿周围脑组织

炎症反应的影响

李飞1，高伟伟1，徐新1，周帅1，刘会敏2，张建宁1△

摘要：目的

探讨二甲双胍干预小鼠脑出血（ICH）后血肿周围脑组织炎症反应的作用机制。方法

60只成年雄

性C57/BL6小鼠，简单随机抽样分成3组：假手术组、模型组和二甲双胍组，每组20只。其中模型组和二甲双胍组经微量注射器向脑实质内注射Ⅵ型胶原酶（1μL，0.075U）制作ICH模型，假手术组注射1μL生理盐水。二甲双胍组小鼠在造模后6h予以二甲双胍（100mg/kg）连续灌胃7d，模型组予以等量的生理盐水灌胃。于治疗后第3、7天应用免疫组化染色方法检测血肿周围脑组织髓过氧化物酶（MPO）、离子钙接头蛋白（Iba-1）表达情况。Westernblot法检测出血后第3天血肿周围的白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达。结果天，二甲双胍组IL-1β、TNF-α的表达水平较模型组降低（P＜0.05）。结论周围炎症因子和炎症细胞的浸润以及小胶质细胞的过度激活。

关键词：脑出血；二甲双胍；动物实验；炎症；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β；髓过氧化物酶；离子钙接头蛋白中图分类号：R743.34

文献标志码：A

DOI：10.11958/20170133

分组处理后第3、

7天，与模型组相比，二甲双胍组小鼠血肿周围脑组织MPO和Iba-1阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）。处理后第3

二甲双胍能够减轻ICH后小鼠脑血肿

Effectsofmetforminoninflammationofbraintissuearoundhematomainintracerebral

hemorrhagemousemodel

1DepartmentofNeurosurgery,2DepartmentofGastroenterology,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,

TianjinNeurologicalInstitute,Tianjin300052,China

△

LIFei1,GAOWei-wei1,XUXin1,ZHOUShuai1,LIUHui-min2,ZHANGJian-ning1△

CorrespondingAuthorE-mail:jianningzhang@hotmail.com

intracerebralhemorrhage(ICH)inmice.Methods

Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectofmetforminoninflammatoryresponsearoundthehematomaafter

Shamgroup,modelgroupandmetformingroup,20miceforeachgroup.ThemodelgroupandmetformingroupwereinjectedThemodelgroupwasgivenequalsalineorally.Theexpressionlevelsofmyeloperoxidase(MPO)andthecalciumbindingICH.Interleukin-1βandTNF-αweredetectedbyWesternblotassayat3daysafterICH.Results

Atotalof60maleC57/BL6micewererandomlydividedinto3groups:

bacterialcollagenase(1μL,0.075U)intothestriatum.TheShamgroupwasinjected1μLsalineintothestriatum.The

metformingroupwastreatedwithmetformin(gavageadministration,100mg/kg)6hafterICHandfor7consecutivedays.protein1(Iba-1)aroundthehematoma(microglia)weredetectedbyimmunohistochemicalstainingat3daysand7daysafterimmunohistochemicalstainingshowedthatthepositiveexpressionlevelsofMPOandIba-1weresignificantlylowerthansignificantlylowerinmetformingroupthanthoseinmodelgroup3daysaftertreatment(P＜0.05).ConclusionICHinmice.

canreducetheinfiltrationofinflammatorycytokinesandinflammatorycellsandtheexcessiveactivationofmicrogliaafterinterleukin-1β;myeloperoxidase;calciumbindingprotein1

Resultsof

thoseinmodelgroup3daysand7daysaftertreatment(P＜0.05).TheexpressionlevelsofIL-1βandTNF-αwere

Metformin

Keywords:cerebralhemorrhage;Metformin;animalexperimentation;inflammatory;tumornecrosisfactor-alpha;

脑出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）是神经外科临床工作中常见病，占所有脑卒中的10%～15%，早期的外科手术可以清除血肿，减轻血肿对脑

作者简介：李飞（1990），男，硕士在读，主要从事颅脑损伤方面研究

△

组织的压迫，缓解局部脑水肿以及炎症反应［1-3］。但

近年来的研究表明，血肿周围的脑组织在ICH早期就已出现炎症细胞及炎症因子的浸润，进而加重脑

作者单位：1天津医科大学总医院神经外科，天津市神经病学研究所（邮编300052），2消化内科通讯作者

E-mail:jianningzhang@hotmail.com

486

水肿，这也是继发性脑损伤的关键因素之一，因此减轻炎症反应是缓解ICH后继发性脑损伤的关键［4-6］。二甲双胍（Metformin）为人工合成的双胍类口服降血糖药，因其药效比较稳定、不良作用少而作为治疗2型糖尿病的一线药物之一。近年的研究发现二甲双胍还具有抑制炎症反应、抗肿瘤、抗氧化以及调节脑水肿等作用［7-9］。为此，笔者通过观察二甲双胍对ICH模型小鼠血肿周围髓过氧化物酶MPO）阳性细胞的浸润、炎症因子肿瘤坏死因子TNF）-α和白细胞介素（IL）-1β的表达以及小胶质细胞激活的影响，探讨其干预ICH血肿周围脑组织炎症反应的机制。1材料与方法

1.1

主要仪器和试剂

标准型脑立体定位仪购自深圳瑞沃

德，微量注射泵、10μL微量注射器购自瑞士Hamilton。二甲双胍、Ⅳ型胶原酶（0.075U/μL）购自Sigma，10%水合氯醛由我院药剂科保存，4%多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司，兔源MPO抗体、离子钙接头蛋白（Iba-1）抗体、TNF-α抗体、IL-1β抗体及免疫组化二抗均购自英国Abcam公司。兔抗小鼠β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2

实验动物分组及造模

健康SPF级成年雄性C57/BL6

小鼠（6~8周，体质量20～25g）共60只，由军事医学科学院提供。按照简单随机抽样的方法分为假手术组、模型组和二甲双胍组，每组各20只。模型组和二甲双胍组小鼠应用5%水合氯醛腹腔麻醉，固定于脑立体定位仪上，取1μLⅣ型胶原酶采用注射泵注射至右侧纹状体（前囟向前0.2mm、中线旁开2.5mm，深3.5mm），1min注射完毕；假手术组在相应位置注射h7后，1μL生理盐水。二甲双胍组在胶原酶注射完毕61.3

d，模型组予以等量生理盐水灌胃。根据小鼠体质量予以二甲双胍100mg/（kg·d）连续灌胃免疫组化检测脑组织中的MPO、Iba-1表达

分别于造

模后的第3天、第7天随机抽取各组小鼠5只，麻醉后4%多聚甲醛心腔灌注，断头取脑。常规制作脑组织石蜡切片，脱水后置于枸橼酸盐缓冲液中加热3%H30min进行抗原修复，然后min；23%O2处理牛血清白蛋白10min抑制内源性过氧化物酶，（BSA）孵育1h；加入MPO蒸馏水洗（1∶50）和5洗Iba-13次，（1∶每次500）5一抗，min，4生物素标记的二抗孵育℃孵育过夜；次日磷酸盐缓冲液2h；HRP-（PBS生物）素偶联的三抗室温下孵育1h；二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染；梯度乙醇脱水后中性树胶封片。光镜下随机选取目标区域5个视野，计数阳性细胞数量（棕黄色颗粒）。所观察人员由非本实验参与人员按照双盲原则进行。1.4Westernblot检测脑组织中的TNF-α、IL-1β的表达

于造模后第3天每组随机取5只小鼠，麻醉后断头取

脑。按照每100mg脑组织加入1mL蛋白裂解液［使用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF）及蛋白酶抑制剂］，将组织于冰上粉

TianjinMedJ,May2017,Vol.45No.5碎、匀浆并提取总蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白浓度并制备蛋白样品。每孔10μg，恒压120V30min，然后80V60min进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（PVDFSDS-PAGE上，5%）脱脂奶粉封闭，湿转法（恒压1h80，加入兔抗小鼠V、90min）将蛋白转移至（1∶1000）、IL-1β抗体（1∶1000），4℃过夜。次日TNF-αTBST抗体

洗3次，每次5min，室温下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶5000）孵育1h，ECL化学发光液显色，扫描仪扫描并记录条带，以β-actin作为内参，ImageJ软件进行条带的处理和分析，记录TNF-α和IL-1β与β-actin的吸光度比值。1.5

统计学方法

应用SPSS19.0软件进行统计分析，符合

正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1出血灶周围MPO、Iba-1阳性细胞检测结果分组处理后的第3、7天，模型组MPO、Iba-1阳性细胞数量均较假手术组增多；经二甲双胍干预后，小鼠脑组织MPO和Iba-1阳性细胞数量较模型组明显减少，差异均有统计学意义，见图1、2。

假手术组

模型组

二甲双胍组

3d

7d150假手术组FF模型组）P=371.00

＜0.01

P=292.40＜0.01

二甲双胍组

数（个100

a

胞细性50

ab

a

阳ab

0

a

与假手术组比较，3db

与模型组比较，7d

P＜0.05

Fig.1Expressions7thdayafterofintracerebralMPOaroundhemorrhagethehematomainthreeonthethirddayand图1ICH后第(Immunohistochemistry3和7天3组血肿周围脑组织staining,×200)

groups

MPO的表达情况

（免疫组化染色，×200）

2.2脑组织TNF-α和IL-1β的表达情况分组处

理后第3天，3组血肿周围TNF-α和IL-1β表达差

（（天津医药2017年5月第45卷第5期

假手术组

模型组

二甲双胍组

3d

7d

F80P=347.92

＜0.01

Fa

P=255.03＜0.01

假手术组模型组个）60数（ab

a

二甲双胍组

胞细性40阳ab

200

a

与假手术组比较，3db

与模型组比较，7Pd

＜0.05

Fig.2Expressions7thdayofIba-1around图2ICH后第(Immunohistochemistryafterintracerebralhemorrhagethehematomaonthethirddayand3和7天3组血肿周围脑组织staining,in×200)

threegroups

Iba-1的表达情况

（免疫组化染色，×200）

异有统计学意义。二甲双胍组小鼠血肿周围α和IL-1β表达较模型组显著减少，见图3。

TNF-TNF-αIL-1ββ-actin1.5假手术组模型组二甲双胍组

FP=659.04＜Fa

0.01P=259.21

＜0.01

假手术组模型组二甲双胍组

1.0

ab

0.5

a

b

0.0

a

与假手术组比较，TNF-αb

与模型组比较，IL-1β

P＜0.05

Fig.3TheimmunoblotICHresultsinthreeofTNF-αgroups

andIL-1βthreedaysafter图3

ICH后的第3天不同实验组TNF-α和IL-1β的表达情况

487

3讨论

炎症反应是引起ICH的致死率和致残率较高，ICH继发性脑损伤的重要因素，其中血肿周围的但目前仍缺乏有效控制脑组织炎症反应的手段［10］ICH小胶质细胞为主的炎症细胞聚集到血肿周围并释放发生后各种炎症细胞如白细胞、巨噬细胞以及。一系列炎症因子，引起继发性炎症损伤［6］。本实验采用胶原酶制作小鼠ICH模型，该方法简便快速、成模率高、出血灶大小稳定，具有较好的可重复性［11］。二甲双胍药效稳定，且不降低非糖尿病患者的血糖，可减轻慢性高血糖引起的脑组织过度氧化[7]以及脂多糖引起的白细胞活性降低、减少细胞凋亡［8］。动物实验已证实二甲双胍可抑制ICH发生后过度的炎症反应，减轻脑水肿以及继发性脑损伤，促进神经功能的恢复［9-12］。同时二甲双胍给药后可进入中枢神经系统，分布于脑组织以及脑脊液中发挥

作用［7，13］

。上述特性为二甲双胍治疗ICH提供了依据。二甲双胍成人最大口服剂量为100mg/kg剂量灌胃可以达到稳定的血药浓度3g/d，研究表明［14］，因此本实验给予100mg/kg能满足本实验要求。

润、炎症因子ICH后血肿周围脑组织大量IL-1β、TNF-α的过度表达以及小胶质MPO阳性细胞浸细胞的过度激活，使血肿周围的正常脑组织水肿加重，神经元变性坏死，加重继发性的脑损害［15］。MPO是一种白细胞酶，常见于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等，过量的MPO导致机体产生过多的氧化物质，引起组织损伤［16-17］。Iba-1是小胶质细胞的特异性标志物，多种中枢神经系统疾病可引起小胶质细胞过度激活，分泌细胞因子，激活后的小胶质细胞迁移到病变区域吞噬细胞碎片和受损的神经元，其活性升高常提示神经元的损伤和凋亡增加［18］。此外，TNF-α和IL-1β是ICH炎症反应的重要介质［19］，可加重血脑屏障的开放，促进神经元细胞的凋亡以及组织水肿。研究显示，ICH后第3天，脑水肿程度和炎症因子浸润达到高峰［20-22］。免疫系统和中枢神经系统是相互作用的，组织损伤通过释放生物活性物质激活炎症反应，过度的炎症反应又造成了神经系统的损伤［23］。本研究发现给予二甲双胍干预的第Iba-13天和第7天，血肿周围脑组织MPO和胍干预的第阳性细胞浸润较模型组明显减少，3天IL-1β、TNF-α表达降低，给予二甲双提示二甲双胍能够减轻血肿周围脑组织炎症反应和小胶质细胞的激活，减轻ICH后的继发性损伤。

综上所述，治疗剂量的二甲双胍可使ICH小鼠血肿周围MPO阳性细胞浸润明显减轻，炎症因子

TNF-α（IL-1β）/β-actin488

TNF-α的过度激活。这有可能是二甲双胍减轻炎症反应的、IL-1β表达减少，同时也抑制了小胶质细胞

重要途径之一。但本研究仅从几个关键炎症因子入手，对于二甲双胍抑制炎症因子的通路以及基因分子水平上的作用机制尚待进一步研究。

参考文献

［1］ThompsonBG，BrownRDJr，Amin-HanjaniS，etal.Guidelinesfor

the

aneurysmsmanagement

：Aguidelineof

patients

forhealthcarewith

unruptured

professionalsintracranial

AmericanHeartAssociation/AmericanStrokefromtheStroke0000000000000070.

，2015，46（8）：2368-2400.doiAssociation：10.1161/STR.

［J］.

［2］vanAschCJ，LuitseMJ，RinkelGJ，etal.Incidence，casefatality，

andaccordingfunctionaloutcomemeta-analysistoage［J］，.sexLancet，andofNeurologyethnicintracerebralorigin，2010：haemorrhagea，systematicover9（2）：167-176.reviewtimedoiand，10.1016/S1474-4422（09）70340-0.

：［3］SaccoS，MariniC，ToniD，etal.Incidenceand10-yearsurvivalof

intracerebralStrokeSTROKEAHA.108.523209.

，2009hemorrhage，40（2）ina：population-394-399.

baseddoi：registry10.1161/

［J］.［4］TaylorRA，SansingLH.Microglialresponsesafterischemicstroke

and746068.intracerebraldoi：10.1155/2013/746068.

hemorrhage［J］.ClinDevImmunol，2013，2013：［5］ZhouY，WangY，WangJ，etal.Inflammationinintracerebral

hemorrhageNeurobiol2013.11.003.

，：2014from，mechanisms115（2）：25-toclinical44.doi：translation10.1016/j.pneurobio.［J］.Prog［6］WangJ.Preclinicalandclinicalresearchoninflammationafter

intracerebral477.doi：10.1016/j.pneurobio.2010.08.001.hemorrhage［J］.ProgNeurobiol，2010，92（4）：463-［7］MousaviSM，NiazmandS，HosseiniM，etal.Beneficialeffectsof

teucriumimpairmentspoliumandandmetforminondiabetes-inducedmemoryAlzheimersDis，2015brain，2015tissue：493729.oxidativedoi：damage10.1155/2015/493729.inrats［J］.IntJ［8］AljadaA.Lipopolysaccharides-inducedinflammatoryresponsein

whitemediatorsblood：cellsisassociatedwithalterationsSyndrinRelatsenescence2015，13（6）modulation：278-285.bydoimetformin：10.10/met.2014.0168.

［J］.MetabDisord，［9］ScheenAJ，EsserN，PaquotN.Antidiabeticagents：potentialanti-inflammatory2015，41（3）：183-194.activitybeyonddoi：10.1016/j.10.1016/j.diabet.2015.02.003.glucosecontrol［J］.DiabetesMetab，［10］MengZ，ZhaoT，ZhouK，etal.A20Amelioratesintracerebral

hemorrhage-polyubiquitinationinduced［J］.inflammatoryJImmunol，2017injury，198by（2regulating）：820-831.TRAF610.4049/jimmunol.1600334.

doi：［11］ChengS，GaoW，XuX，etal.Methylprednisolonesodiumsuccinate

reducesBBBdisruptionandinflammationinamodelmouseofTianjinMedJ,May2017,Vol.45No.5intracranial10.1016/j.brainresbull.2016.10.007.

haemorrhage［J］.BrainResBull，2016，127：226.doi：［12］HuangNL，ChiangSH，HsuehCH，etal.MetformininhibitsTNF-α-induced6phosphorylationproductionIκBinkinase［endothelialphosphorylation，IκB-αdegradationandIL-10.1016/j.ijcard.2008.04.010.

J］.IntJCardiolcellsthrough，2008，PI3K-134（2）dependent：169-175.AMPKdoi：［13］ŁabuzekK，SuchyD，GabryelB，etal.Quantificationofmetformin

byplasmatheofHPLCmethodinbrainregions，cerebrospinalfluidand］2010TanZ，，62Xu（5rats）Z，：Gui956-965.

treatedwithlipopolysaccharide［J］.PharmacolRep，［14Q，etal.Gliquidoneversusmetformin：differential

effectsMedJ（onEnglaorta），2014instreptozotocin，127（7）：1298-1303.

induceddiabeticrats［J］.Chin［15］张明伟，彭俊，刘阳，等.高血压脑出血患者血清和颅内血肿液

中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2010，9（2）：138-141.ZhangMW，PengJ，LiuY，etal.StudyandhematomaonthelevelsfluidofIL-of1βpatients，IL-6，andwithTNF-αinvenousserum［16］hemorrhageHamptonMB［J］，.KettleChinJAJNeurosurg，WinterbournDisResCC.，2010hypertensiveInside，9（2）the：138-141.cerebralneutrophil

Bloodphagosome，1998：，Katyal，oxidants92（9）：A.3007-3017.，myeloperoxidase，andbacterialkilling［J］.［17］RayRSMyeloperoxidase：Bridgingthegapin

neurodegeneration620.doi：10.1016/j.neubiorev.2016.06.031.

［J］.NeurosciBiobehavRev，2016，68：611-［18］FuR，ShenQ，XuP，etal.Phagocytosisofmicrogliainthecentral

（nervous3）：1422-1434.systemdiseasesdoi：10.1007/s12035-013-8620-6.

［J］.MolecularNeurobiology，2014，49［19］BimpisA，PapaloisA，VoumvourakisK，etal.Neuronaltumour

necrosisfactor-αandinterleukin-1βexpressioninaporcine［modelJ］.BrainofintracerebralRes，2015haemorrhage，1615（2）：Modulation：98-105.bydoi\"U-：10.1016/j.743G\"

［20］brainres.2015.04.034.

YamasakiY，MatsuuraN，ShozuharaH，etal.Interleukin-1asa

pathogenetic1995，26（4）：mediator676-680.

ofischemicbraindamageinrats［J］.Stroke，［21］RothwellN，AllanS，ToulmondS.Theroleofinterleukin1inacute

neurodegenerationimplications［J］.JClinandInveststroke，：1998pathophysiological，100（11）：28-2652.andtherapeutic［22］KatsunoM，YokotaH，YamamotoY，etal.Increasedregional

［interleukin-4J］.NeurolMedduringChirthe（acuteTokyostage），of2006severe，46intracranial（10）：471-disorders474；［23］SkaperdiscussionSD，474-475.

FacciL，GiustiP.Neuroinflammation，microgliaand

mastcellsJ］.inCNStheNeurolpathophysiologyDisordDrugofTargetsneurocognitive，2014，13（disorders10）：1654-：a1666.

review［（2017-01-26收稿

2017-03-21修回）

（本文编辑

胡小宁）