第３７卷２０１６年第５期 ９月 中山大学学报（医学科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＵＮ ＹＡＴ—ＳＥＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ） Ｖｏ１．３７ Ｎｏ．５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１６ Ｒ８４８对胸腺基质淋巴细胞生成素Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化的影响 陈壮桂 ，邹小玲 ，潘莉 ，冯定云 ，杨丽芬 ，黎雅婷 ，张天托 （中山大学附属第三医院１√Ｌ科，２．呼吸内科，广东广州５１０６３０） 摘要：【目的】探讨咪喹莫特类似物Ｒ８４８对胸腺基质淋巴细胞生成素（ＴＳＬＰ）介导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化的影响。【方法】 从健康志愿者外周血中提取单个核细胞（ＰＢＭＣ），免疫磁珠分选出ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ，随后用不同因素诱导分化为成熟树突状细 胞（ＤＣ）；另用免疫磁珠阴性分选出Ｎａ＇ｉｖｅ Ｔ细胞后，将其与诱导分化后的ＤＣ共培养，并分组：Ａ组为Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＰＢＳ／ＤＣ；Ｂ组 为Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＴＳＬＰ／ＤＣ；Ｃ组为Ｎａｉｖｅ Ｔ＋（ＴＳＬＰ＋Ｒ８４８）／ＤＣ；Ｄ组为Ｎａ￣＇ｖｅ Ｔ＋（ＴＳＬＰ＋ａｎｔｉ—ＯＸ４ＯＬ）／ＤＣ。ＥＬＩＳＡ检测上清液细胞因 子ＩＦＮ一 、ＩＬ一４和ＩＬ一１３水平，荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ测定转录因子ＧＡＴＡ一３及Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ的表达。【结果】（１）ＴＳＬＰ诱导后 ＤＣ表达ＯＸ４０Ｌ增加，而Ｒ８４８可抑制ＯＸ４０Ｌ表达（Ｐ＜０．０５）。（２）Ｂ、Ｃ、Ｄ三组Ｔ细胞表达细胞因子ＩＬ一４和ＩＬ—ｌ３水平均高于 Ａ组；Ｂ组ＩＬ一４和ＩＬ一１３均较ｃ组和Ｄ组高，而Ｄ组高于ｃ组（均Ｐ＜０．０５）；Ｃ组表达ＩＦＮ一 水平明显高于其余三组（均Ｐ＜ ０．０５）；Ａ、Ｂ、Ｄ三组之间ＩＦＮ一 无明显差异（Ｐ＞０．０５）。（３）Ｃ组和Ｄ组ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ水平均低于Ｂ组，但高于空白对照Ａ 组，其中Ｄ组ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ水平高于ｃ组；ｃ组表达Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ水平高于其余三组（均Ｐ＜０．０５）；Ａ、Ｂ、Ｄ三组之间Ｔ—ｂｅｔ 水平无明显差异（Ｐ＞０．０５）。【结论】ＴｓＩＪＰ通过上调人Ｄｃ表达ＯＸ４０Ｌ，在转录因子水平介导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２细胞分化；这 种 ＩＪＰ介导的Ｔｈ２细胞优势反应可被Ｒ８４８所抑制。 关键词：支气管哮喘；Ｔ淋巴细胞；细胞分化；胸腺基质淋巴细胞生成素；Ｒ８４８ 中图分类号：：Ｒ３９２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２～３５５４（２０１６）０５—０６７１—０７ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ８４８ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｙｍｉｃ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｌｙｍｐｈｏｐｏｅｉｔｉｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＣＨＥＮ Ｚｈｕａｎｇ—ｇｕｉ ，ＺＯＵ Ｘｉａｏ—ｌｉｎｇ２，ＰＡＮ Ｌｉ ，ＦＥＮＧ Ｄｉｎｇ－ｙｕｎ ，ＹＡＮＧ Ｌｉ—ｆｅｎ ，ＬＩ Ｙａ—ｔｉｎｇ ， ＺＨＡＮＧ Ｔｉａｎ．ｔｕｏ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｉｒｃｓ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ；Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ） Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ：ＺＨＡＮＧ Ｔｉａｎ—ｔｕｏ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｔｉｔｕｌｉ＠１６３．ｃｏｒｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒ８４８ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｅｉｔｉｎ（ＴＳＬＰ）ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｉｌｓ（ＰＢＭＣ）ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎｓｉ￣ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｉｒｆｕｇａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖｅｎｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｐｕｒｉｉｆｅｄ ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＴＳＬＰ ｔｏ ｇｅｔ ｍａｔｕｒｅｄ ＤＣ．ＯＸ４０Ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｎ ＤＣ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ．Ｐｕｒｉｉｆｅｄ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ Ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ＰＢＭＣ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｃｕｈｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＤＣ． ｈｅＴ ｃｅｉｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｒｏｕｐｓ，Ｇｒｇｏｕｐ Ａ：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＰＢＳ／ＤＣ；Ｇｒｏｕｐ Ｂ：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＴＳＬＰ／ＤＣ；Ｇｒｏｕｐ Ｃ：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋（ＴＳＬＰ＋Ｒ８４８） ／ＤＣ； Ｇｒｏｕｐ Ｄ：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋（ＴＳＬＰ＋ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ）／ＤＣ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＬ．４， ＩＬ．１３ ａｎｄ １ＦＮ一＾ｙｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＧＡＴＡ一３ ａｎｄ Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（１）ＴＳＬＰ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＣ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＯＸ４０Ｌ ｂｕｔ Ｒ８４８ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯＸ４０Ｌ（Ｐ＜０．０５）．（２）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍｏｒｅ ＩＬ一４ ａｎｄ ＩＬ一１３ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｄ ｗｈｅｎ 收稿日期：２０１６—０４—２１ 基金项目：国家自然科学基金面上项目（８１３７０１１４，８１４７０２１９）；广东省公益研究与能力建设专项资金（２０１４Ａ０２０２１２１２０） 作者简介：陈壮桂，医学博士，硕士研究生导师，儿科副主任医师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｚｈｕａｎｇｇｕｉ＠１２６＿ｃ０ｍ；邹小玲，并列第一作者，医学博士，Ｅ— ｍａｉｌ：ｇ１０８１７＠１６３．ｃｏｍ；￣信作者：张天托，医学博士，博士研究生导师，呼吸内科主任医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｔｉｔｕｌｉ＠１６３．ｃｏｒｎ ６７２ 中山大学学报（医学科学版） 第３７卷 ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ｃ（Ｐ＜０．０５）．Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ｃ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｏｒｅ ＩＦＮ－－／ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）ｗｈｉｌｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐ Ａ，Ｂ ａｎｄ Ｄ（Ｐ＞０．０５）．（３）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆｇｒｏｕｐ Ｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｏｒｅ ＧＡＴＡ－３ ｍＲＮＡ ｔｈａｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｆａｃｔｏｒ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐ Ｃ ａｎｄ Ｄ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ｂ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．ｇ０５），ｗｈｉｌｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｇｒｏｕｐ Ａ，Ｂ ａｎｄ Ｄ（Ｐ ＞Ｏ．０５）．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ ＬＰ ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｔｈ２ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＯＸ４０Ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ＤＣ；Ｒ８４８ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＬＰ ｏｎ Ｔｈ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ；Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ＴＳＬＰ；Ｒ８４８ 虽然支气管哮喘的发病机制尚未明确，但是 Ｔｈ２细胞优势反应在哮喘的发病中起着极其重要 的作用［Ｉ＿２］。我们与其他学者的研究表明【３．５］：胸腺 基质淋巴细胞生成素（ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ．ＴＳＬＰ）是启动Ｔｈ２细胞极化最关键 的因子，当外来刺激如变应原、病毒等作用于气 道，引起气道上皮细胞合成、分泌，ｒＳＩＪＰ增多，后者 通过作用于树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ＤＣ），诱导 ＤＣ表面分子ＯＸ４０Ｌ表达上调，与ＣＤ４＋幼稚型Ｔ 细胞（Ｎａｉｖｅ Ｔ）表面的ＯＸ４０结合，产生的信号传 导至Ｔ细胞内。激活Ｔｈ２特异性转录因子ＧＡＴＡ一 ３．Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２方向分化，从而导致哮 喘的发生。咪喹莫特类似物Ｒ８４８能够减少哮喘小 鼠气道嗜酸性细胞浸润，缓解慢性气道炎症。甚至 逆转气道重塑等哮喘特征性病理改变 ］。在人类 细胞模型的研究表明，Ｒ８４８能够直接诱导ＤＣ 产生ＩＬ一１２．介导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈｌ细胞方向 分化［６－７］。然而。ＴＳＬＰ介导人Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２ 细胞分化的效应是否能够被Ｒ８４８所抑制，目前鲜 有文献报道。因此，本实验拟探讨Ｒ８４８在ＴＳＬＰ 诱导的人Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化过程中的作用．阐明 Ｒ８４８是否能够抑制ＴＳＬＰ介导的Ｔｈ２细胞反应及 其潜在的机制。 １材料与方法 １．１ 主要试剂 抗人ＯＸ４０Ｌ抗体（美国Ｒ＆Ｄ公司）；Ｒ８４８（瑞 士Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）；重组人ＴＳＬＰ（美国 ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ公司）；红细胞裂解液（美国 ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司）：人Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分选磁珠 试剂盒（德国Ｍｉｈｅｎｙｉ生物公司）；人Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ细胞生物素化抗体鸡尾酒＋抗生物素化磁珠、人 ＣＤ１４＋细胞分选磁珠（德国Ｍｉｈｅｎｙｉ生物公司）；流 ［Ｊ ＳＵＮ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ），２０１６，３７（５）：６７１—６７７］ 式抗体：ＰＥ标记的鼠抗人ＣＤ４５ＲＡ，ＦＩＴＣ标记的 鼠抗人ＣＤ４＋．ＰＥ标记的鼠抗人ＣＤｌａ，ＦＩＴＣ标记 的鼠抗人ＨＬＡ—ＤＲ．ＰＥ标记的鼠抗人ＯＸ４０Ｌ，ＰＥ 标记的鼠抗人ＣＤ８６。ＰＥ—ＣＹ５标记的鼠抗人ＣＤ８３ （美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）；人ＩＬ～４、ＩＬ一１３和ＩＦＮ一 ￣／ＥＬＩＳＡ试剂盒（南京凯基生物公司）；ｒｈＧＭ—ＣＳＦ 和ｒｈｌＬ一４（美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）；ＲＴ—ＰＣＲ引物 序列（深圳华大基因公司）；ＲＴ—ＰＣＲ使用试剂、 ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｅｒｉｐｔＴＭ ＲＴ—ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ．宝生物 工程大连有限公司）；Ｔｒｉｚｏｌ试剂（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）。 １．２实验方法 １．２．１ ＤＣ分离培养取健康志愿者５０ ｍＬ外周 静脉血，离心去除红细胞、血小板及血浆等成分， 将剩余的白膜层与ＰＢＳ以１：２比例稀释混匀。随 后按１：１比例加入淋巴细胞分离液，密度梯度法 分离提取出外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），用磁珠分 选出ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ（按说明书操作），经流式细胞 仪测定纯度后，将所得到的ＣＤ１４＋细胞按２．０— ２．５￣１０６／孔加入ｌ２孔板中，每孔加２ ｍＬ含细胞因 子ｒｈＧＭ—ＣＳＦ（１００ ｎｇ／ｍＬ）和ｒｈｌＬ一４（５０ ｎｇ／ｍＬ）的 ＲＰＭＩ １６４０完全培养基，３７℃ＣＯ：培养箱培养。阴 性对照组：ＰＢＳ＋ＰＢＭＣ；ＴＳＬＰ组：ＴＳＬＰ＋ＰＢＭＣ； Ｒ８４８组：ＴＳＬＰ＋Ｒ８４８＋ＰＢＭＣ；其中ＴＳＬＰ浓度为 （１５ ｎｇ／ｍＬ），Ｒ８４８为（１ ｔｚｇ／ｍＬ）。每组分别设４组 平行对照孔，每天于倒置显微镜下观察细胞形态 变化。 １．２．２流式细胞仪测定ＤＣ表面分子表达待上 述细胞培养７２ ｈ后，收集细胞，８００ ｒ／ｍｉｎ离心沉 淀（离心半径ｒ＝１０．８ ｃｍ），去除培养上清液，留取 细胞沉淀，加入ｈｎＬ ＰＢＳ洗涤，１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心分 离，弃上清，细胞沉淀中加入ＰＢＳ以调整细胞浓度 为１ Ｘ １０ 个／ｍＬ至１ Ｘ １０ 个／ｍＬ。先将流式抗体 分别加入试管中，之后每管约加入１００ Ｌ细胞混 悬液，轻涡旋，充分混匀，避光，静置孵育ｌ５～２０ 第５期 陈壮桂，等．Ｒ８４８对胸腺基质淋巴细胞生成素Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化的影响 ６７３ ｍｉｎ。往试管中加入１ ｍＬ ＰＢＳ液，以１ ０００ ｒ／ｒａｉｎ， 离心５ ｍｉｎ，轻柔倒去上清液。流式细胞仪测定表 面ＣＤｌａ、ＨＬＡ—ＤＲ表达水平鉴定为ＤＣ后，测定共 刺激分子ＣＤ８３及ＣＤ８６以了解ＤＣ分化成熟情 况，随后流式细胞仪测定ＤＣ表面ＯＸ４０Ｌ表达情 况。 １．２．３ ＤＣ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞共培养将外周血中提 取出的ＰＢＭＣ以磁珠阴性选择分离获取ＣＤ４＋ ４５ＲＡ＋双阳性Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞，经流式细胞仪测定鉴 别Ｔ细胞纯度，将１．２．１部分诱导分化成熟的ＤＣ 及Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞加入至１２孔板培养．每孔 Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞数约为２．５ ｘｌ０ 个，每孔加入ＤＣ数 约为５ Ｘ １０ｓ个（按１：５比例）。共设４组：Ａ组（空 白对照组）：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＰＢＳ共培养的ＤＣ（ＰＢＳ／ＤＣ）； Ｂ组：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＴＳＬＰ诱导的ＤＣ（ＴＳＬＰ／ＤＣ）：Ｃ组： Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＴＳＬＰ诱导、Ｒ８４８干预的ＤＣ『（ＴＳＬＰ＋ Ｒ８４８）／ＤＣ］；Ｄ组：Ｎａｉｖｅ Ｔ＋ＴＳＬＰ诱导、ａｎｔｉ— ＯＸ４０Ｌ干预的ＤＣ［（ＴＳＬＰ＋ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ）／ＤＣ］。其 中，ＴＳＬＰ浓度为（１５ ｎｇ／ｍＬ），Ｒ８４８为（１ ｐ￣ｇ／ｍＬ）， ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ为（１５ ｎｇ／ｍＬ），每组分别设４复孔。于 共培养第７天，加入ｐｌａｔｅ—ｂｏｕｎｄ ａｎｔｉ—ＣＤ３（５ ｇ／ ｍＥ）和可溶性的ａｎｔｉ—ＣＤ２８（１ Ｉｘｇ／ｍＬ）再次刺激２４ ｈ，收集培养液进行离心，留取上清液，测定细胞因 子ＩＬ一４、ＩＬ一１３和ＩＦＮ一＾ｙ浓度；剩余的细胞沉淀经 ＰＢＳ洗涤后加入Ｔｒｉｚｏｌ １ ｍＬ于一８０℃超低温冰箱 中冻存。待荧光定量ＰＣＲ法测定Ｔ细胞内相关转 录因子ｍＲＮＡ表达水平。 １．２．４ ＲＴ—ＰＣＲ ４定Ｔ—ｂｅｔ和ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ表 达Ｔｒｉｚｏｌ法常规提取各组细胞总ＲＮＡ。按照试剂 盒操作程序逆转录成ｃＤＮＡ，采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法 在Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＦＡＳＴ反应仪中进行分 析。反应条件：９５℃３０ ｓ；９５ ｏＣ ５ ｓ，６０ ｃＩｃ ２０ ｓ；循环 ４Ｏ次。Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内参，引物设计如下：Ｔ—ｂｅｔ上 游弓Ｉ物：５ 一ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＩ＇ＧＴＧＣ一３ ， 下游弓Ｉ物：５ 一ＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＴＡＴＧＣＧＴＧ １Ｔｒ一３ ，扩增长度为１３０ ｂｐ。ＧＡＴＡ一３上游引物：５ 一ＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴ一３ ．５ －ＴＧＡＡＣＡＡＡ ＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＡ一３ ，扩增长度为２０３ ｂｐ。Ｂ—ａｅｔｉｎ 上游引物：５，＿ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ一３ ， 下游弓Ｉ物：５ 一ＣＴｃＣＴＴＡＴＧＴＣＡＣＧｃＡｃＧＡＴＴＴｃ一 ３ ．扩增长度为２３９ ｂｐ。重复３次实验。记录每 个标品３个复孔的ｃｔ平均值。ｍＲＮＡ值＝２－ＡＡＣｔ。 １．３统计学处理 各组实验数据用 ±ｓ表示，ＳＰＳＳ １６．０软件 进行统计学分析，各组间相差比较符合正态分布 的采用单因素方差分析，如非正态分布的采用秩 和检验分析，之后组间差异采用Ｓ－Ｎ—Ｋ分析。Ｐ＜ Ｏ．０５表示有统计学差异。 ２ 结 果 ２．１ 不同干预因素处理后ＤＣ细胞形态比较 ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ培养１ ｄ后可见细胞半悬浮生 长，细胞聚集呈簇状生长。体积小，多为圆形。培养 ７２ ｈ后．于倒置显微镜下观察三组ＤＣ细胞的形 态。此时细胞为脱壁悬浮状态，体积大，形状不规 则，有毛刺状突起。呈现特征性的星状、树突状，为 典型的ＤＣ形状，轻轻吹打即可脱壁（图１）。但三 组细胞之间形态学差异不明显。 ２．２ 不同干预因素处理后ＤＣ表达ＣＤ８３及 ＣＤ８６水平 细胞培养７２ ｈ后．经流式测定细胞表面 ＣＤｌａ、ＨＬＡ—ＤＲ表达。鉴定为ＤＣ后，测定ＤＣ共 刺激分子ＣＤ８３及ＣＤ８６表达。此时ＴＳＬＰ及Ｒ８４８ 组ＤＣ均高表达以上两种分子，为分化成熟的 ＤＣ，而ＰＢＳ对照组低表达以上两种共刺激分子， 为未成熟ＤＣ（图２）。 ２．３不同干预因素处理后ＤＣ表达ＯＸ４０Ｌ水平 采用流式细胞仪测定三组不同干预因素处理 的ＤＣ表面ＯＸ４０Ｌ表达情况．ＴＳＬＰ组ＤＣ表面 ＯＸ４０Ｌ表达率及ＯＸ４０Ｌ荧光强度均明显高于空 白对照（Ｐ均＜Ｏ．０５）；Ｒ８４８组ＯＸ４０Ｌ的表达率及 荧光强度均低于ＴＳＬＰ组（均Ｐ＜０．０５），但高于空白 对照组（尸＜０．０５；表１及图３）。 ２．４不同因素干预处理后ＤＣ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞共培 养对Ｔｈｌ、Ｔｈ２细胞相关细胞因子表达水平的影响 为了研究ＴＳＬＰ预处理后ＤＣ对Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞 极化的影响。以及不同干预处理在Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞极 化过程中的作用，我们使用Ｒ８４８干预ＴＳＬＰ对 ＮａｉｖｅＴ细胞分化的影响（Ｃ组），以及ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ 阻断ＤＣ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞的ＯＸ４０Ｌ—ＯＸ４０通路（Ｄ 组），随后检测细胞上清液Ｔｈｌ、Ｔｈ２类细胞因子的 浓度；结果发现ＴＳＬＰ预处理组（Ｂ组）ＩＬ一４（１８６４ ±１７９）和ＩＬ一１３（２５７５±１１５）水平均较Ｒ８４８干预 组（Ｃ组）（２２５±８，６９７－４－３９）和ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ阻断 组（Ｄ组）（８１８－４－９８，１２５７±８１）高，其中，加人 第５期 陈壮桂，等．Ｒ８４８对胸腺基质淋巴细胞生成素Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化的影响 表１ 不同因素干预处理后ＤＣ中ＯＸ４０Ｌ表达率及表达荧光强度 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＯＸ４０Ｌ ｏｎ ＤＣ ６７５ ３ ｌ １Ｐ＜０．０５ ＶＳ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；２）Ｐ＜０．０５ ＶＳ ＴｓＬＰ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ干预后以上两种细胞因子水平均高于 Ｒ８４８干预组，Ｂ、Ｃ、Ｄ三组Ｔ细胞表达ＩＬ一４和ＩＬ一 １３水平均高于空白对照的Ａ组（１９．４±２．５。２７．１± ７．２）（均Ｐ＜０．０５）。而Ｔｈ１相关的细胞因子ＩＦＮ— 在ｃ（２２８０±２９７）组表达明显高于其余三组（均Ｐ ＜０．０５），Ａ（４０±３）、Ｂ（３７±２）、Ｄ（１５３±４１）三组 之间ＩＦＮ一 无明显统计学差异（Ｐ＞０．０５；图４）。 提示ＴＳＬＰ诱导的ＤＣ介导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２方 向转化，Ｒ８４８以及拮抗ＯＸ４０Ｌ能够抑制ＴＳＬＰ对 Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞的诱导分化作用。同时促进Ｔｈｌ细胞 反应的增强。 ２．５不同因素干预处理后ＤＣ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞 共培养对转录因子ＧＡＴＡ一３及Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ 相对表达水平 ＧＡＴＡ一３和Ｔ—ｂｅｔ分别是Ｔｈ２及Ｔｈｌ细胞的 特异性相关的转录因子，对不同干预因素处理后 Ｔ细胞内转录因子ＧＡＴＡ一３及Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ的表 达水平进行比较，结果发现Ｃ组（１．８９±０．５１）和Ｄ 组（２．７８±０．５９）Ｔ细胞表达ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ水平 ＩＬ一４ ＩＬ一１３ ＩＦＮ一 １）Ｐ＜Ｏ．０５ ＶＳ Ｇｒｏｕｐ Ａ；２）Ｐ＜Ｏ．０５ ＶＳ Ｇｒｏｕｐ Ｂ；３）ｅ＜Ｏ．０５ ＶＳＧｒｏｕｐＣ 图４不同干预组Ｔ细胞表达细胞因子ＩＬ一４、ＩＬ一１３和 ＩＦＮ— 水平 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＬ一４，ＩＬ一１３。ａｎｄ Ⅱ＇Ｎ—Ｙｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ 均低于ＴＳＬＰ—ＤＣ共培养后的Ｂ组Ｔ细胞（５．３１± １．４２），但高于空白对照组（１．２１±０．３５），其中Ｄ组 ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ水平高于Ｃ组（均Ｐ＜０．０５）。Ｃ组 （５．０１±１．６３）表达Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ水平高于其余三 组（均Ｐ＜０．０５）；Ａ（２．４８±０．７６）、Ｂ（１．６８＋０．３２）、 Ｄ（２．０１±０．５３）三组之间该转录因子水平无明显 差异（（Ｐ＞０．０５；图５），表明ＴＳＬＰ在转录因子水 ０苗毒苞 平诱导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２方向极化，拮抗ＯＸ４０Ｌ ８ 可抑制该过程；而Ｒ８４８对ＴＳＬＰ所诱导的Ｔｈ２反 应的抑制作用较ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ显著，并且同时伴有 Ｔｈ１细胞反应的增强。 ２．６不同因素干预处理后对Ｔｈｌ、Ｔｈ２细胞失衡的 影响 为了解三种不同干预因素对Ｔｈｌ／Ｔｈ２平衡的 作用，我们同时对四组Ｔ细胞ＩＬ一４／ＩＦＮ一 及 ＧＡＴＡ一３／Ｔ—ｂｅｔ进行了比较，发现两组比值均为Ｂ 组最高，其次为Ｄ组，Ｃ组最低，各组之间的差异 具有统计学意义（均Ｐ＜０．０５；表２）。这进一步表 １）Ｐ＜０．０５ ＶＳ Ｇｒｏｕｐ Ａ；２）Ｐ＜Ｏ．０５ ＶＳ Ｇｒｏｕｐ Ｂ；３）Ｐ＜Ｏ．０５ ＶＳ ｏｒｕｐ Ｃ 图５不同干预组Ｔ细胞表达转录因子ＧＡＴＡ一３和Ｔ— ｂｅｔ ｍＲＮＡ相对水平 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｆｌａｄ ＧＡＴＡ－３ ａｎｄ Ｔ—ｂｅｔ ｍＲＮＡ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ６ ６７６ 中山大学学报（医学科学版） 第３７卷 明在ＴＳＬＰ的诱导作用下，Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２细 胞分化，Ｔｈｌ／Ｔｈ２平衡明显向Ｔｈ２方向偏移：加入 ａｎｔｉ—ＯＸ４０Ｌ拈抗ＯＸ４０Ｌ后，ＴＳＬＰ对Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞 的作用受到抑制；而Ｒ８４８则完全逆转了ＴＳＬＰ诱 导的Ｔｈｌ／Ｔｈ２失衡，使得该平衡朝Ｔｈｌ方向偏移。 ３ 讨 论 本研究利用体外细胞模型发现．ＴＳＬＰ刺激后 的ＤＣ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞共培养，引起细胞上清液 ＩＬ一４及ＩＬ一１３表达水平明显升高，同时Ｔｈ２细胞 分化特异性转录因子ＧＡＴＡ一３ ｍＲＮＡ表达明显增 加，Ｔｈｌ细胞分化特异性转录因子Ｔ—ｂｅｔ表达减 少，表明ＴＳＬＰ通过ＤＣ介导，从转录因子水平诱 导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２方向定向分化；另一方面， ＴＳＬＰ诱导Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２方向极化效应能够 被加入Ｒ８４８干预后所抑制。提示Ｒ８４８能够在 Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞极化起始阶段。下调ＴＳＬＰ所介导的 Ｔｈ２细胞优势应答，纠正Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞的失衡 ＯＸ４０Ｌ是肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）超家族中的一 员，主要表达于ＤＣ、巨噬细胞等ＡＰＣ以及Ｂ细胞 表面㈣。ＯＸ４０Ｌ在Ｔｈ２分化的过程中起着“开关” 的作用 ，Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞表面表达ＯＸ４０，ＴＳＬＰ能够 促进ＤＣ表达ＯＸ４０Ｌ，当ＤＣ表面ＯＸ４０Ｌ与Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞表面表达ＯＸ４０相互结合，产生的信号传导 至Ｔ细胞内，引起活化Ｔ细胞核因子ｃｌ（ＮＦＡＴｃ１） 向胞核聚集［９１，促使Ｔ细胞表达ＩＬ一４增多．ＩＬ一４ 与Ｔ细胞上的ＩＬ一４受体（ＩＬ一４Ｒ）相互作用后．促 进ＳＡＴＡ一６磷酸化并向胞核迁移，进而上调转录 因子ＧＡＴＡ一３表达，最终使Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞增殖分化 为Ｔｈ２细胞＿ｌｏ］。我们在ＴＳＬＰ与ＤＣ共培养的同 时，加人ＯＸ４０Ｌ单克隆抗体（ＯＸ４０ＬｍＡｂ）进行阻 断，发现ＯＸ４０ＬｍＡｂ干预后Ｔｈ２细胞相关细胞因 子ＩＬ一４、ＩＬ一１３以及转录因子ＧＡＴＡ一３的表达水 平较单独ＴＳＬＰ干预组明显下降，提示ＴＳＬＰ诱导 的Ｔｈ２细胞优势分化是由ＯＸ４０Ｌ—ＯＸ４０这一途径 所介导的。 咪喹莫特是ＴＬＲＴ／８的特异性配体，能诱导Ｔ 细胞产生Ｔｈｌ相关细胞因子ＩＦＮ一 和ＩＬ一１２，使 机体免疫反应向Ｔｈｌ方向偏移［ｎ－１２￣。作为一种强 有效的免疫佐剂，咪喹莫特已被批准用于临床治 疗［”］。Ｒ８４８是咪喹莫特的类似物，同样为ＴＬＲ７／８ 配体，已有研究报道其具有类似咪喹莫特的功能， 能够诱导产生Ｔｈｌ相关细胞因子如ＩＦＮ一＾ｙ及直接 促进活化Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ１分化的ＩＬ—ｌ２，并且 抑制Ｔｈ２细胞因子如ＩＬ一４和ＩＬ一５生成，从而调节 Ｔｈｌ／Ｔｈ２反应，使免疫反应朝Ｔｈｌ方向进行［７，１４］。 那么ＴＳＬＰ介导人Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２细胞分 化的效应是否能够被Ｒ８４８所抑制？为了探讨 Ｒ８４８在ＴＳＬＰ诱导人Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞极化过程中所 起的作用，阐明Ｒ８４８的作用靶点。我们比较ＴＳＬＰ 单纯作用于ＤＣ和加入Ｒ８４８进行干预后，ＤＣ表 面分子的表达情况，结果发现．ＴＳＬＰ可使ＤＣ表面 分子ＯＸ４０Ｌ表达上调，在此基础上若给予Ｒ８４８ 进行干预。则ＤＣ表面ＯＸ４０Ｌ的表达明显受抑制． 且ＴＳＬＰ对Ｔｈ２的诱导作用被明显抑制，表现为细 胞上清液Ｔｈ２相关细胞因子如ＩＬ一４、ＩＬ—ｌ３的生 成减少，转录因子ＧＡＴＡ一３ｍＲＮＡ的表达下降：由 此可见，Ｒ８４８通过下调ＤＣ表面ＯＸ４０Ｌ的表达， 抑制ＯＸ４０Ｌ—ＯＸ４０途径介导ＮａｉＶｅ Ｔ细胞向Ｔｈ２ 细胞优势分化。本研究与Ｌｏｍｂａｒｄｉ等的结果相一 致［ ｊ，Ｒ８４８干预组Ｔｈｌ相关的细胞因子ＩＦＮ～＾ｖ表 达水平显著高于其他干预组 提示Ｒ８４８可通过促 使Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞向Ｔｈｌ细胞方向分化。增强Ｔｈｌ细 胞的功能，纠正Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞比例失衡。 综上所述，Ｒ８４８通过下调ＤＣ表面分子 ］Ｊ １Ｊ］● ］Ｊ １第５期 陈壮桂，等．Ｒ８４８对胸腺基质淋巴细胞生成素Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞分化的影响 … ６７７ ＯＸ４０Ｌ的表达．通过ＯＸ４０一ＯＸ４０Ｌ途径．在Ｎａｉｖｅ Ｔ细胞极化起始阶段抑制ＴＳＬＰ介导的Ｔｈ２反应． 纠正Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞功能失衡。临床上已经使用咪 唑喹啉胺类药物对一些疾病进行治疗。在皮肤病 临床治疗上．咪喹莫特作为一种强有效的免疫佐 剂，已被批准用于治疗人乳头状病毒引起的生殖 器疣［”］，取得一定的疗效，因此，本研究所得结果 有望成为针对哮喘患者ＯＸ４０Ｌ进行精准治疗潜 在的药物。 参考文献 ＤＥＣＫＥＲＳ Ｊ． ＢＲＡＮＣＯ ＭＡＤＥＩＲＡ Ｆ，ＨＡＭＭＡＤ Ｈ． Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ｆ Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１３，３４（１１）：５４０—５４７． 陈壮桂，纪经智，李鸣，等．免疫调节剂对哮喘患儿血 ＩＬ一４及ＩＦＮ一 的影响及临床疗效分析［Ｊ］．中山大学 学报：医学科学版，２００９，３０（１）：１００—１０３． ＣＨＥＮ ＺＧ．肛ＪＺ，ＬＩ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｎ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＬ一４ ａｎｄ ＩＦＮ一＿ｙ ｉｎ ａｓｔｈｍａｔｉｃ ｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．Ｊ Ｓｕｎ Ｙａｔ—ｓｅｎ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ），２００９，３０（１）：１００—１０３． ＣＨＥＮ ＺＧ，ＺＨＡＮＧ ｒｒｒ．Ｕ ＨＴ。ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＬＰ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｉｒｗａｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｌａｌｅｒｇｉｃ ａｓｔｈｍａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（１）：ｅ５１２６８． 李洪涛，张天托，陈壮桂，等．布地奈德对支气管哮喘 小鼠树细胞胸腺淋巴细胞生成素受体表达的影响 ［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２０１２，３５（７）：４９７—５０２． ＬＩ ＨＴ． ＺＨＡＮＧ ｒｒｒ． ＣＨＥＮ ＺＧ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｎｄｅｓｏｎｉｄｅ ｏｎ ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｍｆｉｌｅ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＯＶＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｔｕｂｅｒｃｕｌ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ，２０１２， ３５（７）：４９７—５０２． ＩＴＯ Ｔ。ＬＩＵ ＹＪ． ＡＲＩＭＡ Ｋ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＴＳＬＰ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ一一ＴＳＬＰ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｔｈｅ“Ｔｈ２ ｃｏｄｅ’’ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｌｌｅｒｇｏｌＩｎｔ，２０１２，６１（１）：３５—４３． ＣＡＭＡＴＥＲＯＳ Ｐ，ＴＡＭＡＯＫＡ Ｍ，ＨＡＳＳＡＮ Ｍ，ｅｔ ａ１． Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｓｔｈｍａ—ｉｎｄｕｃｅｄ ａｉｒｗａｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ一７／８ ｌｉｇａｎｄ￥２８４６３［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ ＣａｒｅＭｅｄ，２００７，１７５（１２）：１２４１－１２４９． ［７］ＴＯＲＩＩ Ｙ， ＩＴＯ Ｔ， ＡＭＡＫＡＷＡ Ｒ， ｅｔ ａ１． Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ａｃｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８，１８１（８）： ５３４０—５３４９． ［８］ＣＲＯＦＴ Ｍ，ＳＯ Ｔ，ＤＵＡＮ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ ｏｆ ＯＸ４０ ａｎｄ ＯＸ４０Ｌ ｔｏ Ｔ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００９，２２９（１）：１７３—１９１． ［９］ＳＩＤＤＩＱＵＩ Ｓ，ＭＩＳＴＲＹ Ｖ，ＤＯＥ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｉｒｗａｙ ｗａｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ［Ｊ］．Ｃｈｅｓｔ，２０１０，１３７（４）：７９７—８０４． 『１０］ＹＯＨ Ｋ， ０ＪＩＭＡ Ｍ，ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ Ｓ．Ｔｈ２一ｂｉａｓｅｄ ＧＡＴＡ一３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｓｅｖｅｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈｌ－ｂｉａｓｅｄ Ｔ—ｂｅｔ ａｎｄ Ｔｈ１７－ｂｉａｓｅｄ ＲＯＲ￣ｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ａｎｉｍ， ２０１５，６４（４）：３５３－３６２． ［１１］ＺＨＯＵ ＣＸ，ＬＩ Ｄ，ＣＨＥＮ ＹＬ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ—ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ａｓ ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｏｆｒ ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｖｅｔ Ｒｅｓ，２０１４，３（１０）：２． ［１２］ＩＧＡＲＴＵＡ Ｍ，ＰＥＤＲＡＺ ＪＬ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ： ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔ ｏｆｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ？［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２０１０，９（１）：２３－２７． ［１３］ＣＯＨＥＮ ＰＲ，ＳＣＨＵＬＺＥ ＫＥ，ＴＳＣＨＥＮ ＪＡ，ｅｔ ａ１． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｍａｍｍａｒｙｐａｇｅｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｏｐｉｃａｌ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ｃｒｅａｍ：ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］． Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｄ Ｊ，２００６，９９（４）：３９６—４０２． ［１４］ＧＲＥＬＡ Ｆ，ＡＵＭＥＵＮＩＥＲ Ａ，ＢＡＲＤＥＬ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ＴＬＲ７ ａｇｏｎｉｓｔ Ｒ８４８ ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ［Ｊ］． ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８６（１）：２８４—２９０． ［１５］ＬＯＭＢＡＲＤＩ Ｖ，ＶＡＮ ＯＶＥＲＴＶＥＬＴ Ｌ，ＨＯＲＩＯＴ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｖｉａ ＴＬＲ７ ａｎｄ／ｏｒ ＴＬＲ８ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－１０，ＩＦＮ－ ｇａｍｍａ，ａｎｄ ＩＬ一１７Ａ ｂｙ Ｎａｉ＇ｖｅ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１８２（６）：３３７２－３３７９． （编辑刘清海）
