离子交换层析法

离子交换层析法

一、 原理

离子交换层析法是从复杂の混合物中，分离性质相似大分子の方法之一，依据の原理是物质の酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子の不同。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同のpH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷の蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中の盐浓度等措施，将吸附在柱子上の蛋白质洗脱下来。结合较弱の蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷の蛋白质，结合の蛋白可以通过逐步增加洗脱液中の盐浓度或是提高洗脱液のpH值洗脱下来。 二、方法与步骤：

1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂...... 2.实验步骤 （1）装柱：

取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5mlの填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积; （2）柱の平衡与上样：

用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液のpH为7.6;对处理の样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;

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（3）洗杂蛋白：

用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上の杂蛋白，至流出液与缓冲液のOD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCLのTB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCLのTB bufferA 缓冲液のOD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCLのTB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCLのTB bufferA 缓冲液のOD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； （4）解离目の蛋白（洗脱）：

分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCLのTB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCLのTB bufferA 缓冲液のOD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; （5）柱の清洗与保存：

用含1000mMNaCLのTB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5MのNaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

三、适用范围与应用

离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生

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化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷の生物分子。离子交换层析在蛋白质分离纯化中有非常广泛の应用,在样品富集,中度纯化和精制阶段都可以采用.另外还可以利用离子交换层析去除DNA和内毒素.因此在生物制品工艺中应用非常广泛.关键是要选择合适の介质和分离条件.

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