2012年兽医专业 家畜传染病学、禽病学 实验指导

家畜传染病学、禽病学 实验指导

目录

第一部分 基本技术

一、消毒 二、免疫接种

三、剖检技术及病变检查要点 四、细菌分离、培养技术 五、药敏试验

六、病毒分离培养技术 七、鸡胚接种技术 八、动物试验技术 九、病原体的鉴定方法

第二部分 传染病实验室诊断技术

一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术 二、减蛋综合征的诊断及抗体检测 三、马立克氏病琼扩试验

四、鸡传染性法氏囊病琼扩试验 五、鸡传染性喉气管炎的诊断 六、传染性支气管炎的诊断及防制 七、包涵体肝炎的实验室诊断 八、禽脑脊髓炎的实验室诊断 九、鸡传染性贫血的实验室诊断 十、禽霍乱的诊断 十一、鸡白痢的检疫 十二、鸡枝原体的检疫

十三、大肠杆菌病的实验室诊断 十四、禽流感的实验室诊断 十五、炭疽的诊断和防治 十六、布病的实验室诊断 十七、结核的实验室诊断 十八、巴氏杆菌的实验室诊断 十九、口蹄疫的实验室诊断 二十、兔瘟的诊断

二十一、乳胶凝集试验检测猪细小病毒 二十二、犬细小病毒的实验室诊断

二十三、间接血凝抑制试验测定猪瘟抗体

二十四、乳胶凝集试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 二十五、乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病毒抗体 二十六、乳胶凝集试验测猪萎缩性鼻炎病毒抗体 二十七、猪圆环病毒的血清学诊断

第三部分 疫苗制造技术

一、新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造 二、鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗的制造

三、鸡新城疫LaSota系弱毒疫苗的制造 四、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗制造 五、氢氧化铝胶苗的制造

六、动物脏器组织灭活疫苗的制造 七、油乳剂灭活疫苗的制造 八、猪瘟兔化弱毒苗的制备

第四部分 抗备技术

一、传染性法氏囊病高免卵黄抗体的制备 二、抗新城疫高免血清的制备 三、猪瘟高免血清的制备及应用 四、抗体提纯技术

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第一部分 基本技术

一、消毒

1．人员的消毒：所有进入禽场生产区的人员，必须在更衣室内更衣换鞋，然后方可进入场区。要控制或谢绝参观人员进入禽舍内。在场区(生产区)入口应设有喷雾消毒装置和消毒池。喷雾消毒药物可用0.1%新洁尔灭或3～5%来苏儿，使用新洁尔灭时应避免与肥皂或碱类接触，以防减弱其杀菌能力，消毒池要经常更换消毒药液。凡进入场内的人员及车辆都必须经过消毒。也可采用紫外线照射消毒。

2．禽舍消毒：禽舍在消毒前必须进行彻底清扫与冲刷，以增强消毒效果，一般按以下步骤进行消毒：

向禽舍的空间喷洒雾状消毒剂，使禽舍内空中飘浮的尘埃沉落，常用药为3～5%的来苏儿溶液。

将舍内一切可移动的设备移出。进行洗刷和消毒。夏季应尽量利用阳光曝晒消毒；用1～2%热氢氧化钠，20%草木灰，10～20%石灰乳洗刷墙壁和地面；金属笼或用具冲洗晾干后，用0.1%新洁尔灭溶液喷洒，或用火焰喷射消毒。

最后将禽舍密闭堵严，用甲醛熏蒸消毒。根据禽舍污染微生物种类和密闭程度，一般每平方米空间用甲醛20～40毫升，高锰酸钾是甲醛的半量(即2毫升甲醛、1克高锰酸钾、1毫升清水)放在大容量瓷器内进行熏蒸消毒。操作时先把盛有高锰酸钾的瓷器放在需要烟熏消毒的地方，然后加入甲醛，决不可将高锰酸钾加到甲醛中去，这两种药物结合后生成大量的热，所以在操作完后应立即离开现场，切忌使烟雾进入眼内。熏蒸时间最少2～4小时，延长至8小时更好，消毒后，要打开窗户，排除剩余的甲醛蒸气，消毒后的禽舍应闭置1～2周后再使用。

3．用具的消毒：禽场的蛋箱、笼子、雏盒、工具等。应先洗刷干净，晾干或晒干，再放到密闭的房间内用甲醛熏蒸5～10小时，进行严格消毒。

4．孵化消毒：种蛋的消毒方法很多，下面介绍几种：(1)消毒法：将种蛋放入孵化机内，关闭进、出气孔和鼓风机。每立方米用30毫升，另加15克高锰酸钾，经20～30分钟后，打开门和进出气孔，开动鼓风机。这种方法对病毒和霉形体的消毒效果显著。(2)新洁尔灭消毒法：新洁尔灭溶液呈碱性，忌与肥皂、碘、高锰酸钾配用。消毒种蛋时配成千分之一浓度的溶液。喷于种蛋表面。有较强的除污和消毒作用。(3)氯消毒法：将种蛋浸入含1.5%活性氯的漂白粉溶液中3分钟，取出晾干。(4)高锰酸钾消毒法：用千分之5的高锰酸钾溶液泡种蛋1分钟，取出晾干。注意高锰酸钾溶液必须现配现用。(5)红霉素消毒法：将孵化前的种蛋先加温至37.8℃，然后置于2～4℃红霉素溶液中。浸泡15分钟。红霉素溶液的浓度是每1000毫升含400～1000毫克。(6)氢氧化钠消毒法：将种蛋浸泡在0.5%的氢氧化钠溶液中5分钟。能有效地杀灭蛋壳表面的鼠伤寒沙门氏菌。(7)庆大霉素消毒：用100毫升水含0.5克庆大霉素的溶液浸泡种蛋，能杀死种蛋中严重污染的沙门氏菌。孵化室每天用3%来苏儿喷洒消毒，蛋盘、出雏器用3%来苏儿洗刷消毒后，再用清水冲洗干净。

5．环境消毒：禽场周围每季度喷洒消毒一次，运动场每年更换一次表土或清扫干净用火焰彻底消毒。

6．粪便消毒：最常用生物热消毒法。即用堆粪法进行消毒。在距离场100米以外设一粪场。堆粪的方法如下：在地面挖一浅沟，深红约20厘米、宽约1.5～2米，长度不限，随粪便多少而定。先将非传染性的粪便或秸、秆等堆至25厘米厚，其上堆入欲消毒的粪便、垫草等，高达1～1.5米，然后在粪堆外面再铺上10厘米厚的非传染性的粪便或麦草，并覆

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盖10厘米厚的沙子或土，如此堆入三个星期到三个月，即可用以肥田，若粪便太干可加入适量水，当粪便较稀时应加杂草，使其不稀不干，以促其迅速发酵。

7．带动物消毒：常用药物有过氧乙酸、新洁尔灭、抗毒威等，可按说明使用。

消毒药种类很多，理想的消毒药物应具有下列特性：(1)价廉易得；(2)对人、畜安全；(3)易溶于硬水；(4)对用具和纺织物不会损伤；(5)在空气中较稳定；(6)无恶臭味；(7)无残余毒性；(8)在肉或蛋中不会有积存；(9)对杀灭大多数病原微生物有效。

目前尚无一种消毒药能全部符合上述要求，因此选用消毒药时应根据具体情况而定，常用化学消毒剂见表1。

表1 常用化学消毒剂 消毒剂 名称 苛性钠 (火碱) 生石灰 草木灰 漂白粉 使用浓度 1～3%热 溶液 10～20% 乳剂 10～20% 热溶液 0.5%～20%一般常用为2～5% 2～5% 使用对象 禽舍、车船、用具等 同上 注意事项 对病毒性传染病消毒效果很好。但对皮肤有腐蚀作用禽舍消毒后数小时用清水冲洗后才能放入家禽。 必须新鲜配制。如用1～2%碱水和5～10%石灰乳混合液消毒效果更好。 同上 用10公斤水和2公斤草木灰煮沸2小时，过滤后备用，用时再加2～4倍热水稀释。 饮水、污水、禽含氯量应在25%以上，新鲜配制，用其澄清液，对舍、用具、车船、金属用具和衣物有腐蚀作用。禽舍消毒后应彻底通土壤和排泄物 风以防中毒。 器械、用具和洗手等 禽舍、土壤和用具等 孵化器、蛋壳、蛋盘等 用于含大量蛋白质的分泌物或排泄物消毒时，效果不够好。 即来苏儿粗制品，注意点同上 来苏儿(石炭酸) 臭药水 5～10% (甲醛溶液) 新洁尔灭 过氧乙酸

5～10% 0.1% 0.2～0.5% 空气消毒时可用熏蒸法，每立方米空间用20毫升，加10克高锰酸钾和10毫升水在瓷器内，室内密闭消毒至少半小时后彻底通风 蛋壳消毒，洗手 且市售5%新洁尔灭20毫升，加25%亚钠20毫升，清水加至1000毫升即成。使用时不能接触肥皂或洗衣粉。 禽舍、除金属制对各种病原微生物杀灭效果都很好，价格低廉，无品外，可用于各公害，禽舍消毒时可喷雾，用具可浸泡 种对象 二、免疫接种

免疫接种是预防和控制传染病的一项极为重要的措施。免疫接种就是用人工的方法，把有效疫苗或菌苗引入动物体内，从而激发机体产生特异性抵抗力，使易感动物转化为有抵抗力的动物，以免传染病的发生和流行。免疫接种的目的，就是提高动物对传染病的抵抗力，预防传染，保证动物健康。

(一)免疫程序的制订

免疫程序就是预防计划，它包括预防疾病的种类、疫苗的选择、免疫次数、免疫时间、

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免疫方法、联合用苗等内容。没有任何一个免疫程序能适用所有地区或不同类型的养殖场。因此，每一个养殖场都应按照自己的实际情况制订适合本场特点的免疫程序。只有这样才能有效地预防传染病的发生。

免疫程序的制订，至少考虑以下8个方面的因素：(1)当地疾病的流行情况及严重程度；(2)母源抗体的水平；(3)上一次免疫接种引起的残余抗体水平；(4)家禽的免疫应答能力；(5)疫苗的种类；(6)免疫接种方法；(7)各种疫苗接种的配合；(8)对动物全身健康及生产能力的影响。这8个因素是互相联系，互相制约的，必须统筹考虑。一般来说，免疫程序的制订首先要考虑当地疾病的流行情况及严重程度。据此才能决定需要接种什么种类的疫苗，达到什么样的免疫水平。首次免疫接种时间的确定，除了考虑疾病的流行情况外，主要取决于母源抗体的水平。如新城疫母源抗体滴度低的要早接种；母源抗体滴度高的推迟接种效果更好。

(二)疫苗的种类

预防动物传染病的疫苗可分为两大类：一类是灭活疫苗，是把病毒或细菌灭活后制成的；类是活毒疫苗或弱毒疫苗，一般是用毒力较弱，不会引起动物发病的活病毒或细菌制成的。弱毒疫苗按生产过程不同，又分为湿苗及冻干苗两种。一般来说湿苗使用方便，免疫效果好，但不能长期保存，而冻干苗保存期长。

下面是几种常用的家禽疫苗。

1．目前我国已生产的新城疫疫苗有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等四个品系，它是把新城疫疫苗病毒接种于鸡胚经一定时间培养后制成的活毒疫苗。Ⅰ系疫苗(又称为印度系)毒力较强，其次是Ⅳ系疫苗(Lasota)，Ⅱ系(B1系)苗毒力较弱，Ⅲ系(F系)苗最弱。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系苗适用于雏鸡和成鸡，一般接种后不会引起严重反应，只出现轻微呼吸道症状或完全没有症状。但Ⅰ系苗毒力比较强，只供2个月以上鸡使用，接种后引起的反应比较重，然而免疫效力最强。适合疾病严重流行的地区使用。一般来说，为了安全起见，在使用Ⅰ系苗之前，要先用Ⅱ系或Ⅲ系苗进行基础免疫。另外，目前还用Ⅳ系弱毒苗灭活后制成的新城疫油乳剂灭活疫苗，效果优于各种弱毒疫苗，大小鸡均可用，不但安全，而且免疫期长。

2．鸡痘疫苗

目前预防鸡痘的疫苗有两类：一类是由鸽痘病毒制成的，另一类是由鸡痘弱毒病毒制成的。

鸽痘弱毒苗适用于各种年龄的鸡，对一日龄雏鸡也没有不良反应，但免疫力差些，一般免疫期为3～4个月。

鸡痘弱毒苗适用于20日龄的鸡，用于雏鸡接种可能会引起严重的反应，个别甚至会死亡，免疫期五个月左右。

上述两种疫苗在接种后均应出现局部反应，如局部红肿增厚、毛囊肿胀或局部皮肤出现豆大的小疱等，如果接种部位不见反应，应重新接种一次。

3．马立克氏病疫苗

目前世界上已有三类疫苗：(1)强毒化疫苗；(2)自然弱毒疫苗；(3)火鸡疱疹病毒FC126株疫苗，对1日龄雏鸡作肌肉或皮下接种0.2毫升，只能防止肿瘤的发生，但不能防止马立克氏病强毒的感染。因此，接种越晚，雏鸡感染马立克氏病毒的危险性越大。近来已有由上述两种以上毒株组成的多价疫苗，免疫效果更好。

4．禽霍乱菌苗

目前生产的禽霍乱菌苗有灭活菌苗和弱毒菌苗两类，弱毒菌苗在国内外育成的菌株有很多个。但弱毒苗的各个菌株，其免疫效果均不理想，一般免疫期仅三个月，有时会更短。不同菌株所引起的接种反应不同，但有时同一菌株甚至是同一批菌苗，在不同情况下反应也不相同。国内现已研制出油佐剂灭活菌苗，安全，免疫期较长。

禽霍乱弱毒菌苗和灭活苗还有许多不足之处。国内外都开始了亚单位疫苗的研制工作，

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并得了初步效果。

5．传染性支气管炎疫苗

目前使用最广的弱毒株是H52和H120，两者均为马萨诸型。此外，还有别的血清型，如康涅狄格，也有灭活苗。H120毒力比较温和，适用于幼龄雏鸡。H52毒力稍强，一般用于1月龄以上的鸡或加强免疫。弱毒苗免疫有效期不长，每隔2～3个月重复接种一次，可获得坚强保护力，如果接种某一血清型的疫苗后仍不能防止疾病的发生，应该选用别的血清型的疫苗或多价苗。

6．传染性法氏囊病疫苗

目前有两种疫苗：一种是灭活苗，须加佐剂，否则无效。另一种是弱毒苗，不瘟和型和中等毒力型等，其应用对象及剂量等有所不同。国内已试制出PBC98弱毒疫苗，是一种温和型弱毒苗。对1日龄雏鸡进行肌肉注射，28日龄时进行饮水免疫，实践证明安全有效。

7．传染性喉气管炎疫苗 目前有两种疫苗：一种是弱毒疫苗，可用于滴眼，滴鼻或毛囊接种；另一种是强毒疫苗，只能用于擦肛或滴肛，如经呼吸道接种则会引起严重发病。

8．鸭瘟疫苗

现在普遍使用的是鸭胚培养、鸡胚培养或细胞培养的弱毒疫苗。我国有好几个单位培育的鸭瘟疫苗弱毒株，安全有效，一般无不良反应。

9．减蛋综合征疫苗

目前使用的主要是用鸭胚生产的、加有油佐剂的灭活疫苗，效果良好。 (三)疫苗的选择和使用

疫苗的种类很多，各有优缺点和适用范围，不可乱用，否则不但不能起到预防疾病的作用，反而会影响动物的健康，甚至会把本来没有的疾病带入养殖场。因此，必须根据不同情况，慎重使用。

一般来说，需要接种哪些种类的疫苗，主要取决于当地流行的或可能流行的疾病种类，经过调查和了解，当地有该种疾病的流行或可能受到威胁时，才进行该种疫苗的接种，尤其是该疫苗是毒力强的活毒苗或活菌苗，更不应当轻率地引入从没有该病发生的地区进行接种。

对于已有该病流行或威胁的地区，选用什么类型的疫苗，主要是根据疾病流行的严重程度。一般流行较轻的，可选用比较温和的疫苗。例如新城疫可用Ⅱ系、Ⅲ系等缓发性疫苗。而疾病严重流行的地区，则要选用效力较强的疫苗，如新城疫Ⅰ系等中发性疫苗。总之，要使疫苗接种后产生的抵抗力与疾病流行的情况相适应，使动物有足够坚强的免疫力。

有些疫苗往往有几个品系，一般来说，初次接种应该选择毒力弱的品系，而重复接种(又称强化接种)则应选用毒力较强的品系，例如新城疫疫苗。目前我国已有4个品系，作为初次接种，可选用Ⅱ系、Ⅲ系，而重复接种，可选用Ⅳ系或Ⅰ系苗。

在选用疫苗时，还应考虑该疫苗对动物接种后是否会引起不良反应。例如禽霍乱弱毒菌苗如果用于产卵鸡，会引起产卵量短期下降。如果有其它病并发，也会引起死亡。此外，新城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗等接种，可能造成使本来不明显的败血霉形体病严重暴发，因此当鸡群中有败血霉形体病潜伏存在的情况下，又要进行上述疫苗接种时，应该考虑提前一、二天给要免疫接种的鸡连续服用药物，以便减轻或防止疾病的暴发。

在选择疫苗时，必须注意疫苗的质量，质量的好坏直接影响免疫效果。疫苗的质量除与制造厂生产过程有关外，与贮存、运输及使用过程是否妥当也关系极大。以下是贮存、运输及使用过程中影响疫苗的质量的一些因素：

1．保存条件：不同类型的疫苗，要求的保存条件是不一样的。必须按说明书规定的条件保存，才能保证疫苗质量不会显著下降，一般来说，灭活苗要保存于2～15℃的阴暗环境

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中，活菌苗应保存于4～8℃的冰箱中，这两种疫苗都不应冻结保存。但对于冻干的弱毒活毒(菌)苗，除了个别的有不同要求之外，一般都要求低温保存。保存温度要稳定，尤其不能反复冻融。

2．保存期：使用前检查瓶签上的截止有效期，离截止有效期越近，疫苗病毒(或细菌)死亡越多。因为即使在最适宜的保存条件下，疫苗病毒(或细菌)也会缓慢死亡。

3．运输过程：疫苗运输时，通常达不到低温的要求，因此运输时间越长，疫苗中的病毒(或细菌)死亡越多，如果中途转运多次，影响就更大。

4．疫苗的稀释：各种疫苗所用的稀释剂、稀释倍数及稀释方法，都有一定的规定，必须严格按使用说明书进行。否则，疫苗的滴度会下降，影响免疫效果。例如，用于饮水的疫苗稀释剂，最好是用蒸馏水或去离子水，但不能用自来水，因为自来水中的消毒剂会把疫苗毒杀死。又如用于气雾的疫苗稀释剂，应该是用蒸馏水或去离子水，如果稀释水中含有盐，雾滴喷出后，由于水分蒸发，盐类浓度提高，会引起疫苗病毒死亡。如果能在饮水或气雾的稀释剂中加入0.1%的脱脂奶粉，会有助于对疫苗病毒的保护。在稀释疫苗时，应使用注射器先吸入少量稀释液注入疫苗瓶中，充分振摇溶解后，再加入其余的稀释液，如果疫苗瓶太小，不能装入全量的稀释液，需要把疫苗吸出入在另一容器内，再用稀释液把原疫苗瓶冲洗几次，使全部疫苗病毒(或细菌)都被冲洗下来。

5．疫苗的使用：疫苗在临用前由冰箱取出稀释后应尽快使用，活毒疫苗一般应在4小时内用完。马立克氏病疫苗应在两小时内用完。当天未用完的疫苗，应废弃，不要隔天再用。疫苗无论在稀释前后都不应受热或晒太阳，更不许接触消毒药，稀释疫苗的一切用具，必须洗涤干净，煮沸消毒。饮苗的容器也要洗干净，无消毒药残留。

(四)免疫接种的途径和方法

对家禽进行免疫接种的常用方法有：滴眼、滴鼻、翼下刺种、羽毛囊涂擦、滴肛或擦肛、皮下或肌肉内注射、饮水法及气雾法等。采用哪一种方法，应根据具体情况决定，既要考虑工作方便及经济核算，更要考虑疫苗的特性及免疫效果。

1．滴眼、滴鼻：这种方法适用于新城疫Ⅱ系、Ⅲ系及Ⅳ系疫苗，法氏囊弱毒疫苗，传染性支气管炎疫苗及传染性喉气管炎弱毒型疫苗等的接种，对幼雏应用这种方法，可以避免疫苗病毒被母源抗体中和，并能诱导粘膜免疫，从而有比较良好的免疫效果。滴眼、滴鼻法是逐只进行接种，能保证每只禽都得到免疫，并且剂量一致，免疫效果确实。因此，一般认为，滴眼、滴鼻法是疫苗接种的最佳方法，尤其是对新城疫接种更是如此。

进行滴眼、滴鼻法接种时，可把１０００羽份的疫苗稀释于５０毫升的生理盐水中，充分摇匀，然后于每只禽的眼结膜或鼻孔上滴一滴（０.05毫升）。也可把１０００只份的疫苗稀释于１００毫升的生理盐水中，然后于每只禽的眼结膜及鼻孔上各滴两滴。

２．翼下刺种：此法适用于鸡痘疫苗、新城疫Ⅰ系疫苗等的接种。进行接种时，将１０００羽份的疫苗稀释于25毫升的生理盐水中，充分摇匀，然后用接种针或蘸水笔尖蘸取疫苗，刺种于鸡翅膀内侧无血管处，小鸡刺种１针即可，较大的鸡可刺种２针。

３．羽毛囊涂擦：此法可用于鸡痘疫苗的接种，但已少用。

４．滴肛或擦肛：此法仅用于传染性喉气管炎的强毒型疫苗。方法是把1000只份的疫苗稀释于30毫升的生理盐水中，然后把鸡的肛门向上，将肛门粘膜翻出，滴上疫苗1滴。

５．皮下注射：现在广泛使用的马立克氏病疫苗是火鸡疱疹病毒，宜用颈背皮下注射接种。通常是把100０只份的疫苗稀释于木200毫升稀释溶液中，然后每只雏注射０.2毫升。另外，各种油乳剂灭活疫苗也适用于皮下注射法。

６．肌肉注射：此法是把疫苗直接注射于肌肉内，禽霍乱弱毒菌苗或灭活菌苗以肌肉内注射较好。此法作用迅速，剂量准确，效果确实。新城疫Ⅰ系苗肌肉注射免疫效果比滴眼、滴鼻好，灭活苗必须用注射法，不能口服，也不能用于滴眼、滴鼻。

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肌肉内注射，一般按疫苗使用说明书稀释后，较小的禽只注射0.5毫升，成禽则每只注射１毫升。肌肉注射以胸部肌肉为好，应斜向前入针，以防刺入肝脏、心脏或胸腔内造成死亡，对较小禽只尤其要注意。

７．饮水法：对于大群禽只（例如一群超过10000只）逐只进行免疫接种费时费力，且不能于短时间内达到全群免疫。对于产卵期和产卵盛期的鸡群，为避免骚扰禽群，常采用群体免疫法。群体免疫法中最常用，最易做的，就是饮水法。目前采用饮水法较广泛，效果又较好的疫苗有新城疫Ⅱ系及Ⅳ系苗、传染性支气管炎Ｈ52及Ｈ120疫苗．传染性法氏囊病弱毒疫苗等。饮水法免疫虽然省时省力，但由于种种原因会造成每只禽饮水的疫苗量不一，免疫效果参差不齐。而且，很多研究者证实，饮水法引起的免疫反应最小，往往不能产生足够的免疫力，不能抵抗较强毒力的毒株引起的疾病流行，尤其是对速发嗜内脏型（亚洲型）的新城疫是如此。

为使饮水法免疫达到一定效果，必须注意以下几个问题：

（1）用于饮水法的疫苗必须是高效价的，且疫苗剂量加大2～3倍。

（２）稀释疫苗的饮水必须不含有任何使疫苗灭活的物质，例如：氯、锌、铁等离子，必要时要用蒸馏水。

（３）饮水器具要充足，以保证所有禽只能在短时间内饮到足够的免疫量，饮水器具要干净，饮水前必须彻底清除铁锈、脏物等，以免降低疫苗效价。

（４）饮疫苗前停止饮水２～４小时（视天气及饲料等情况而定），以便使禽只能尽快而又一致地饮用疫苗。第二天再以同样剂量和方法重复饮水免疫一次。

（５）饮水中最好能加入0.1%的脱脂奶粉。

（６）稀释疫苗的用水量要适当。正常情况下，可参考下表稀释： 鸡龄 ４天～２周 ２周～４周 ４周～８周 ８周以上

（７）饮水法免疫接种间隔时间不要太长，一般２～３个月进行一次。

８．气雾法：此法是用压缩空气通过气雾发生器，使稀释疫苗形成直径１～１０微米的雾化粒子，均匀地浮游于空气之中，随呼吸而进入禽体内，以达到免疫。

气雾免疫不但省时省力，而且对某些呼吸道有亲嗜性的疫苗效果最好，例如新城疫各系疫苗，传染性支气管炎弱毒疫苗等。但是气雾法免疫对禽群的干扰大，尤其会加重败血霉形体及大肠杆菌引起的气囊炎。必要时可在气雾免疫前后在饲料中加入抗菌药物。

气雾免疫就应注意的问题是：

（1）疫苗必须是高效价的，而且通常应使用加倍的剂量。

(2)稀释疫苗应该用去离子水或蒸馏水，最好加入0.1%的脱脂奶料或明胶。

(3)雾粒大小要适中，一般以喷出的雾粒中直径在1～10微米占70%以上为最好，雾粒过大，停留于空气中的时间短，也易被粘膜阻止，不能吸入呼吸道；雾粒过小，则吸入后易被呼气时又排出。

(4)气雾免疫房舍应密闭，减少空气流动，并应无直射阳光，保证舍内有适宜的温度与湿度。夜间气雾免疫最好，此时鸡群密集而安静，喷雾20分钟后打开门窗即可。

(五)紧急接种

当一个养禽场已经发生疫病，威胁到禽舍或禽场时，为了迅速控制和扑来疫病的流行，

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每５００只 １０公斤水 １４公斤水 ２０公斤水 ４０公斤水 一个重要的措施就是疫区及受威胁的禽群进行紧急接种。紧急接种可以用免疫血清或疫苗。实践证明，在疫区内使用疫苗进行紧急接种，不但可以防止疫病向周围地区蔓延，而且对某些疫病，如新城疫及鸭瘟，还可以减少已发病禽群的死亡损失。这主要是利用疫苗产生免疫力快的特点，使未受感染的家禽获得抵抗力，但是对正处在潜伏期或尚未明显发病的家禽，有可能促使发病和死亡，经过段时间后，发病及死亡数就会迅速下降，使疫病得到控制。

紧急接种应该包括养禽场内所有禽只，以使禽群一致地获得免疫力，而不留下易感禽。这样强毒病原体就不会一代一代传下去。例如发生新城疫时，对2个月龄以上的鸡可用Ⅰ系苗，幼龄鸡可用Ⅱ系进行紧急接种。为了保证接种效果，疫苗剂量可加倍，但必须注意不是所有疫苗均可用于紧急接种，只有被证明紧急接种确实有效的疫苗(新城疫Ⅰ系、Ⅱ系、鸭温弱毒疫苗)才能使用。另外，一般先接种健康的或无明显症状者，然后再接种可疑感染者或发病者，以防人为地将病原体由病禽传给健康禽只，扩大疫情。

(六)免疫接种的一般注意事项

1．接种前应对禽群进行详细了解和检查，注意营养状况和有无疫病。一般鸡群健康，可保证接种安全，相反，可能出现明显的接种反应，甚至发病，产生免疫力差。因此免疫接种应于禽群健康状况良好时进行为宜。

2．接种前应考虑雏禽母源抗体水平，决定首次免疫接种时间。雏鸡的母源抗体，一方面可以抵抗病原的传染，另一方面又能妨碍疫苗接种后的免疫反应。一般来说传染性支气管炎的母源抗体可维持2周左右，新城疫的母源抗体3周后完全消失，但传染性法氏囊病的母源抗体可持续4～5周龄。雏鸡的母源抗体受母禽抗体的影响。由于母禽免疫接种时间的不同，或者孵化的种蛋来源不同，因此后代雏鸡的母源抗体水平就会有较大的差异。所以就很难规定一个统一免疫程序而适用于各养禽场。如新城疫，根据母源抗体的检测结果，对于母源抗体水平低而个体差异又较小的雏鸡，首次接种应在早龄进行；相反，母源抗体水平高的雏鸡，应推迟疫苗接种时间。对于母源抗体水平参差不齐，差别很大，而该地区又存在有新城疫威胁时，应早用苗，以提高母源抗体水平低的雏鸡的免疫力，然后再接种一次，使本来母源抗体水平较高的雏鸡，也能对疫苗接种有良好的反应，重复接种可根据监测血凝抑制抗体的情况，如果多数鸡只血凝抑制抗体下降到1:16以下时，就应进行强化免疫。

3．接种弱毒活菌苗前后各5天，禽群应停止使用对疫苗菌株敏感的药物，以免影响免疫效果。此外，抗病毒性疾病的疫苗的常加入某些抗菌药物，如青霉素、链霉素等。如果与弱毒活菌苗混合使用，则会降低疫苗的活菌数，从而也会影响免疫效果。

4．一个养禽场往往都不只进行一各种疫苗的接种。因此必须考虑到各种疫苗的互相配合，以减少相互之间的干扰作用，保证免疫的效果。例如一日龄雏鸡同时进行马立克氏病疫苗和新城疫疫苗接种时，新城疫疫苗的免疫效果受到抑制，新城疫疫苗与传染性支气管炎疫苗同时接种时，一般无不良影响，但如果分别接种，则认为支气管炎疫苗接种14天内不应接种新城疫疫苗，否则新城疫疫苗的免疫效果显著下降。为了保证免疫效果，对当地流行最严重的传染病，最好能单独进行接种，以便产生坚强的免疫力。从免疫学的角度考虑，任何疫苗都以单使用时效果最好，并已被实践证明。

5．使用各种疫苗，一定要按说明书的要求做，才能确保免疫效果。要做好免疫接种的详细记录。记录内容至少应包括：接种日期、禽群的品种、日龄、数量、使用疫苗的名称、厂名、批号、生产日期及有效期、稀释剂及稀释倍数、疫苗接种方法、操作人员等。

6．免疫接种后，要注意观察禽群接种疫苗后正常的异常的反应，如有不良反应或发病等情况，应采取适当的措施，并向有关部门报告。疫苗接种经过一定时间(10～20天)后，应检查免疫效果。尤其是改用新的免疫程序及疫苗种类时更应检查。

(七)免疫接种失败的原因分析

禽群经免疫接种后，抵挡不住特定疫病的流行(例如：接种鸡新城疫疫苗后仍发生鸡新

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城疫)，或者效力检查不合格(例如鸡新城疫疫苗接种后，血凝抑抗体滴度不能达到应有的水平或抽检攻毒保护率低于标准要求)。均认为免疫接种失败。

分析免疫接种失败原因，必须从客观实际出发，周密地考虑各方面的因素，切忌主观武断。事实上，每次免疫接种失败，都有其特殊的原因，但为了便于分析，开阔思路，把一些可能的原因归纳如下，以供参考。

1．雏禽在免疫接种时，存在有母源抗体。

2．疫苗选择不当，在疫病严重流行的地区，仅选用安全性好，但免疫效果较低的疫苗品系，例如，在有速发嗜内脏型新城疫流行的地区选用Ⅲ系苗。

3．免疫接种途径错误，例如，1周龄内的雏鸡，采用饮水法接种新城疫疫苗；强化免疫时，把新城疫Ⅰ系疫苗用于点眼、滴鼻。把灭活苗用于饮水等。

4．疫苗质量差。

5．疫苗运输、保管不当，造成疫苗失效或减效。 6．使用超过有效期的疫苗。

7．免疫接种工作不认真，例如采用饮水法免疫时饮水器不足，进行疫苗稀释时计算错误或稀释不均匀，没有把应该接种的禽只全部接种等。

8．鸡群中有免疫抑制性疾病存在，如法氏囊病、马立克氏病等。 9．不同种类疫苗之间的干扰作用。 10．服用抗菌药物或免疫抑制性药物。 11．接种时禽群内已潜伏有强毒病原微生物，或由接种人员及接种工具带入强毒病原微生物。

三、剖检技术及病变检查要点

病理剖检和病变检查是诊断传染病的重要方法之一。它既可验证临床诊断结果的正确与否，又可为实验室诊断方法和内容的选择提供进一步的参考依据。 对家禽的基本剖技术可参考下述方法：

1．将病、死禽只羽毛、皮肤用水浸湿，以减少空气染污。用力压迫，使髋关节断袭，两腿叉开。

2．在靠近胸骨柄处剪开腹肌，沿两侧胁骨缘向前剪开胸肌，用力将胸骨向上折断、掀起，充分暴露胸腔和腹腔。

3．先检查胸腔脏器，如心、肺、气囊等；再检查腹腔脏器，如肝、脾、肾、法氏囊、卵巢、睾丸、气囊、输卵管、输尿管及胃、肠浆膜，观察有无变性、坏死、肿瘤等明显异常变化。需要做细菌或病毒分离培养时，则应按照无菌手续采取所需病料。最后剖开口腔、气管、食道、胃及肠管检查有无典型病理变化。

四、细菌分离、培养技术

细菌分离培养不仅是确诊传染病的重要和可靠手段，而且也是进上步研究病原特性，如耐药性、致病性和生化特性等必不可少的步骤。病原细菌分离培养的一般方法如下：

1．采取接种材料：分离细菌一般多采取心血、淋巴结、肝脏或脾脏，雏鸡白痢可取胆汁或未吸收完的卵黄。所选病料应在病鸡自然残废后立即采取，并严格按照无菌要求操作。病料取好后应尽快接种到培养基上，不应久放，以免被杂菌污染或病料中细菌死亡而得出错误培养结果。

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2．制备培养基：一般大多数细菌在普通营养琼脂平板或肉汤中均能良好生长，因此最常用的培养基主要是普通琼脂或肉汤。为了特殊目的，有时需用特殊培养基，例如禽霍乱巴氏杆菌，为检查其荧光性菌落，要用血清琼脂平板（普通琼脂中加入10%的鸡或绵羊血清）；为让其生长更旺盛并检查有无溶血性，要用血液琼脂平板（普通琼脂中加入10%的新鲜绵羊血）。另外，对霉形体、孤菌、霉菌及传染性鼻炎等病原体的分离培养，也需要较特殊的培养基。

普通琼脂的制备方法：取牛肉汤100毫升，加蛋白胨1克，氯化钠0.8克，琼脂粉2克，加热使其充分溶化，用NaHO溶液调PH7.8，15磅高压灭菌30分钟，冷至45℃左右时倾注于干烤消毒过的平皿中，每个平皿约20毫升，冷却凝固后用消毒纸包好放4℃冰箱备用，可保存1～2周。

若上述培养基中不加琼脂粉便叫普通肉汤。将普通肉汤装入10毫升的试管中，每管2～3毫升，高压灭菌30分钟后放4℃冰箱备用，可保存数月。

3．细菌的接种：将选好的病料放于灭菌容器内，在无菌室或无菌罩或酒精灯下，以烧热的铁片或剪刀在病料表面烧烙消毒，然后在烧烙处剪一小口，用接种棒插入小口，勾取少量组织接入肉汤内，或在普通琼脂平板上划线接种，然后将接种过的肉汤或平皿放入37℃温箱培养18～24小时，观察细菌生长情况，并将培养物涂片染色镜检，或进一步纯培养后作生化试验，动物接种试验或药敏试验。根据以上培养特性，染色镜检特性、生化试验结果以及动物接种结果对疫病做出最后诊断。不同细菌的各种特性可参考后面有关内容或微生物学教材。

所有过程都应严格无菌操作。

五、病原菌药敏试验

抗菌药物（中草药、抗菌素、磺胺类等）是兽医临床常用的药物，但是各种病原体对抗菌药物的敏感性各不相同，同时，由于抗菌药物的广泛应用，以及广谱抗菌素的不断增加，它们虽然对病原体有一定的作用，但在使用不当时常导致抗药性的形成，甚至干扰机体内的正常微生物群的作用，反而对机体带来不良影响。因此，测定病原菌对抗菌药物的敏感性，正确使用抗菌药物，对于临床治疗工作具有重要的意义，药敏试验有以下几种方法。

（一）纸片法

纸片法操作简单，应用也最普遍。 抗菌素纸片的制备

1．将质量较好的滤纸用打孔机打成直径6毫米的圆片，每100片放入一小瓶中，160℃干热灭菌1～2小时，或用高压灭菌（15磅30分钟）后在60℃条件下烘干。

2．抗菌药物的浓度（用蒸馏水或生理盐水稀释） 青霉素 200单位/毫升 其他抗菌素 1000微克/毫升 磺胺类药物 10毫克/毫升 中草药制剂 1克/毫升 3．用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液1毫升，加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1～2小时，如立即试验可不烘干，若保存备用可用下法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存六个月）。

（1）培养皿烘干法：将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2～3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。

（2）真空抽干法：将放有抗菌药物纸片的试管，放在干燥器内，用真空抽气机抽干，一般需要18～24小时。

4．将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用，并用标准敏感菌株作

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敏感性试验，记录抑制圈的直径，若抑菌圈比原来的缩小，则表明该抗菌药物已失效，不能再用。

培养基：一般细菌如肠道杆菌及葡萄球菌等可用普通琼脂平板；链球菌、巴氏杆菌或肺炎球菌等可用血液琼脂平板；测定对磺胺类药物的敏感试验时，应使用无蛋白胨琼脂平板。 菌液：为培养10～13小时的幼龄菌液（抑菌圈的大小受菌液浓度的影响较大，因而菌液培养的时间一般不宜超过17小时）。

试验方法：用白金耳取培养10～18小时的幼龄菌，均匀涂抹于琼脂平板上，待干燥后，用镊子夹取各种抗菌素纸片，平均分布于琼脂表面（每个平板放置4～5片），在37℃温箱内培养18小时后观察结果。

结果测定：根据抗菌纸片周围无菌区（抑菌区）的大小，测定其抗药程度。因此，必须测量抑菌圈的直径（包括纸片），按其大小，报告该菌株对某种药物敏感与否。 1．青霉素抑菌圈的标准： 抑菌圈直径 ＜10毫米 10～20毫米 ＞20毫米 2．其他抗菌素及磺胺类药物的敏感标准： 抑菌圈直径 ＜10毫米 11～15毫米 ＞15毫米 3．中药抑菌素的标准： 抑菌圈直径 ＜15毫米 15毫米 15～20毫米 （二）快速敏感试验――葡萄糖指示法 许多细菌能分解葡萄糖而产酸，使培养基PH值发生改变，若在培养基中加入抗菌药物，接种的细菌对抗菌药物敏感时，培养基中的葡萄糖就不被细菌分解利用，不会形成酸性物质，PH值不发生变化，因而指示剂也不变色，相反，细菌对抗菌药物不敏感时，抗菌药物抑制不了该菌的生长繁殖，因而分解葡萄糖并产酸，使加入其中的溴甲酚紫由紫变黄，以此来测定细菌对药物的敏感性。具体操作方法如下：

1．抗菌素纸片及菌液的准备，同纸片法。

2．配制指示培养基：取普通琼脂15毫升，加入1%葡萄糖及0.6%溴甲酚紫指示剂0.7毫升。

3．灭菌后，待培养基凉至50℃左右时，加入菌液0.5毫升，充分混匀后（防止气泡）作倾注培养。

4．待凝固后，用镊子将抗菌素纸片分别贴于表面，于37℃条件下培养24小时后观察。 5．结果判定：纸片周围有细菌生长者呈现黄色，不生长时仍为紫色，并侧量抑菌圈的直径，判定其敏感方法，方法同纸片法。

（三）试管法

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敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感 敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感 敏感性 抗药 中度敏感 极度敏感 试管法是将药物作倍比稀释，观察不同含量对细菌的抑制能力，以判定细菌对药物的敏感度，常用于测定抗菌素及中草药对细菌的抑制能力。

试验方法：取无菌试管10支，排列于试管架上，于第一管中加入肉汤1.9毫升，其余9管各加入1毫升，吸取配制好的抗菌素原液、磺胺类原液或中药原液0.1毫升，加入第一管中，充分混合后吸出1毫升吸入第二管中，混合后，再从第二管移1毫升到第三管，依此移到第九管中，吸出1毫升弃去。第十管不加药液作对照。然后向各管中加入幼龄菌液稀释液0.05毫升（培养17小时的菌液作1:1000稀释，培养6小时作1:10稀释），于37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。

结果测定：培养18小时后，凡无细菌生长的药物最高稀释管中即为该菌对药物的敏感度。若由于加入药物（如中药）而使培养基变为混浊，眼观不易判断时，可进行接种或涂片染色镜检判定结果。

药物名称 磺胺类药 链霉素 青霉素 多粘菌素、庆大霉素 金霉素、土霉素、 四环素、红霉素 新霉素、氯霉素 合霉素

影响抗菌药物敏感试验的因素

1．器材：抗菌药物敏感性试验是利用微生物学方法进行的，其用量极微，实验仪器的规格和精确度会直接影响实验结果，因此必须严格要求。试管、吸管、培养皿和其它器皿，尤其是定量用的吸管，均须选用中性，硬质一级品，并且必须经过彻底灭菌。

2．培养基成分：培养基成分不但影响敏感菌株的生长繁殖，并可影响到抑菌圈的直径。不同批号的蛋白胨，所含的氨基氮的总量不同，因而抑菌圈大小有一定差别。氯化钠、琼脂中的钙、镁离子影响链霉素、新霉素的扩散，尤其是氯化钠对链霉素影响大，含量越高，抑菌圈越小，甚至不出现反应，但氯化钠对多粘菌素反而有助于扩散。琼脂含量和平板厚度也影响抑菌圈的大小，含量大，影响抗菌素的扩散，一般以1.3～1.6%的浓度较合适，琼脂层过厚抑菌圈也较小，以2～4厘米为最适宜。磺胺类药用琼脂平板法试验时，不能含蛋白胨，因胨会使磺胺失去作用。血清成分的吸附或结合作用，会使金霉素、中药提取物抗菌作用减弱。

表4 抗菌素的溶解度、稳定性及保存有效期 抗菌素 青霉素： 溶解度及稳定性 易溶于水，在中性水溶液中较稳定，尢在PH6～6.5的磷酸盐缓冲液中最稳定 易溶于水，水溶液中较稳定 溶于水，溶解度为132毫克/毫升，PH6.3缓冲液中溶解12

敏感（微克/毫克） ＜50 ＜5 ＜0.1 ＜1 ＜2 中度敏感（微克/毫克） 50～1000 5～20 0.1～0.2 1～10 2～6 抗药（微克/毫克） ＞1000 ＞20 ＞2 ＞10 ＞6 保存期 4℃2～3周，-10℃可延长1倍 4℃保存2周 4℃有效期2周 链霉素 盐酸四环素

盐酸金霉素 氯化四环素和氧化四环素 新霉素 紫霉素硫酸盐 卡那霉素硫酸盐 多粘菌素 杆菌肽 氯霉素 红霉素 黄霉素 1000微克/毫升 易溶于水，溶解度0.5～0.6毫克/毫升，PH2～5之间较稳定，高浓度PH2～2.9范围更稳定 溶于水，酸性溶液较稳定 易溶于水 易溶于水，溶解度500毫克/毫升 溶于水，250毫克/毫升，PH2～9范围稳定 PH3～5的溶液中最稳定 易溶于甲醇、乙醇，也能溶于水，在酸性环境中稳定 微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮及醋酸中 易溶于有机溶媒中，水中溶解度仅为2毫克/毫升，PH7最稳定 易溶于N/10氢氧化钠溶液，乙醇、乙醚，溶解度1%，耐热，蛋白胨、血清成分可阻止其抑菌作用 4℃有效期60天 4℃有效期6周 4℃,1年 4℃，1年 4℃，有效期半年 4℃，1周 4℃，1周 4～20℃有效期1年 4℃，二个月

3．敏感菌株：菌种的敏感度差别较大，如金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感。四联球菌对四环素族最敏感。大肠杆菌对链霉素、多粘菌素敏感。因此，接种量要适宜，接种量多，即使最敏感的菌株也不能抑制其发育，影响实验结果。

4．标准液和被检液：要用同一方法和在同一条件下配制，避免因操作方法不一致而造成误差。

5．培养时间：细菌在发育过程中，对数期繁殖最快，以后处于稳定和衰落期，必须掌握这一规律和特性，以便达到预期试验目的。时间过短则细菌不繁殖，过长则敏感性降低，抑菌圈不清楚。一般以37℃16～18小时为适宜。

6．PH值：对实验结果有显著的影响，新霉素、链霉素在碱性环境中活性最大，而在酸性时抑菌圈缩小。四环素族以酸性为佳。青霉素、氯霉素以中性为宜。

六、病毒分离培养技术

病毒分离培养是确诊病毒性传染病的最可靠方法之一，其分离培养技术包括鸡胚接种、动物接种和细胞接种分离培养。其中最简便、适用因而也最常用的是用鸡胚分离培养病毒。

1．接种材料的制备

分离、培养病毒用的材料除了应新鲜、无菌外，还要做一些特殊处理。首先应将所选取的病料在无菌容器中剪碎、研磨，并根据所培养病毒特性用肉汤、生物盐水或特定稀释液将

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病料作1:5～10稀释。然后按稀释后的病料悬液量计算并加入双抗（青、链霉素），使两者最终浓度达每毫升1000单位或微克，并在4℃环境下作用1～2小时，离心沉淀后取上清液作为分离培养病毒的接种材料。

2．病料接种

若用鸡胚分离、培养病毒，则多选9～12日龄之间的发育鸡胚。许多病毒、特别是大多数禽病毒都能在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然后严格消毒接种部位和气室，用打孔器打孔后，每胚接种处理好的病料0.1～0.2毫升。接种后要用石蜡将孔口封死，放37℃环境中继续孵育48～96小时。不同病毒其接种部位、方法和培养时间不尽一样。可参考后面各有关内容。

若用动物分离、培养病毒，则最好选用本种动物或自然易感动物。除此之外，常用于分离病毒的实验动物有小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠等。兔子的接种常采用肌肉注射、耳静脉注射，剂量一般是1毫升。小白鼠、大白鼠、豚鼠常采用腹腔注射，剂量一般为0.2～0.5毫升。接种动物所用病料的处理与鸡胚接种法相同。动物接种后要单独饲养，不断观察，按照规定时间收获病毒并进行鉴定。

根据病毒种类的不同，鸡胚接种后病毒可在不同部位生长、繁殖，例如新城疫病毒在尿囊液和羊水中、喉气管炎病毒和痘病毒在绒毛膜上含量最高。其它试验动物接种后亦是如此，即不同种类的病毒存在于不同的部位，如猪瘟病毒接种家兔后主要存在于血液、脾脏和淋巴结，而狂犬病毒主要存在于接种动物的脑和神经组织中。因此收获病毒时应根据其生长、存在部位来选取不同的组织器官。

除了鸡胚和动物外，细胞体外培养也是分离病毒的常用方法，但由于所需物品，试剂和条件要求较严格，有些病初次分离不易在人工培养细胞上生长，而且技术难度较大，因此在一般基层单位难以开展推广应用，故不作介绍。

七、鸡胚接种技术

鸡胚接种技术用途广泛，除了可以分离培养病毒、枝原体及衣原体等病原以确诊传染病外，还可用于病毒的鉴定，效价测定，致病力测定及制造疫苗、抗原等。因此掌握鸡胚接种技术对进行传染病的研究和防制工作非常有用。下面介绍鸡胚接种的基本技术。

1．选胚

根据需要选用合适日龄的鸡胚，大多数病毒适于9～12日龄的鸡胚。鸡胚应以白色蛋壳者为好，便于照蛋观察。鸡胚应发育正常，健康活泼，不要过大、过小或畸形蛋孵化的胚。鸡胚应来自健康无病的鸡群，而且不能含有可抑制所接种病毒的母源抗体，最好选用SPF鸡胚或非免疫鸡胚。

2．照蛋定位

接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室位置，再于胚胎侧画出接种位点（进针点），接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚头约1cm左右。

3．接种

照蛋定位完毕后，即可开始接种。先用碘酊将接种位点和气室消毒，再用70﹪酒精脱碘，然后根据需要用三棱针或20号针头在蛋壳上打孔。根据部位，鸡胚接种有以下几种方法（可参照图1）

（1）尿囊腔接种

这是最常用的接种方法，鸡新城疫、减蛋综合症病毒、传染性支气管炎病毒、法氏囊病毒等均可采用这种方法。蛋壳消毒后，先在气室上打一小孔，再于胚胎一侧近气室处所画位点打一小孔，用带5～7号针头的注射器插入孔内约1.5厘米，接种接种材料0.1～0.2毫升。

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进针时针头与蛋壳应保持30℃角，不应垂直进针，注射完毕，立即用溶化的热石蜡将注射口和气室上小孔密封，然后放回37℃孵化箱孵化72～120小时。

（2）绒毛尿囊膜接种

该方法主要用于痘病毒、喉气管炎病毒和马立克氏病毒等的分离培养。将卵壳消毒后，先在气室上打一小孔，再于胚胎侧靠近气室处避开大血管用电烙铁或钢锯条将蛋壳打开一个4毫米见方的小口，用刀尖小心撬开蛋壳，不能损伤卵壳膜，形成卵窗。用针尖轻轻挑破卵窗中心的卵壳膜，但不能损伤卵壳膜下的绒毛尿囊膜。在针尖挑破处滴一滴灭菌生理盐水或甘油，然后用吸头在气室小孔上吸气，使胚内造成负压，这时卵窗处绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见生理盐水或甘油迅速渗入。用注射器滴加2～3滴接种物于卵窗的绒毛尿囊膜上，以透明胶纸封住卵窗。气室小孔用石腊密封，接种后的鸡胚平放在孵化箱中，卵窗向上，不要转运。

（3）卵黄囊接种

此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：气室端蛋壳消毒后，在气室打一小孔，用带7号针头的注射器垂直刺入约3厘米，注射接种物0.1～0.2毫升。石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次。

4．接种后的孵化和观察

接种后继续在37℃孵化，每天照蛋2次，死胚随时取出。一般24小时内死亡的胚多因创伤或细菌污染所致，故弃去不用。24小时以后死亡的胚，取出后放4℃冰箱，并作上记号。接种后的孵化时间长短随病毒种类不同而不同，一般新城疫病毒、支气管炎病毒、减蛋综合征病毒和法氏囊病毒要孵化48～120小时，喉气管炎病毒、马立克氏病毒要孵化48～96小时，痘病毒要孵化4～5天，脑脊髓炎病毒要孵化至小鸡出壳。

5．收毒

接种鸡胚孵化到规定时间后，应从孵化器中取出放4℃环境冷冻36小时左右，或在-10℃以下速冻4小时左右，但不得使鸡胚冻结，否则易发生溶血。冷冻完毕按下列步骤收毒：

（1）鸡胚放于蛋盘或蛋架上，气室向上，用碘酊、酒精消毒后，以无菌镊子敲开气室蛋

壳或去掉人工卵窗的透明胶纸，暴露卵膜。注意不要让卵壳碎屑掉入鸡胚内。

（2）根据接种部位，病毒种类或需要，收获相应的鸡胚材料如尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜、胎儿、卵黄囊等，有时需要收获全胚（除去卵黄和蛋白），如新城疫病毒、马脑炎病毒等。

尿囊液：气室打开后，用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳膜，然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用巴氏吸管刺破绒毛尿膜直接吸取尿囊液。为防止羊膜堵住吸管口，可用镊子轻轻压下羊膜及胎鱼和，然后再吸。每个鸡胚一般可收8毫升左右尿囊液。

羊水：吸完尿囊液后，可用镊子夹住羊膜，将巴氏吸管直接插入羊膜腔吸取羊水，然后再用镊子提起羊膜或压住胎儿，直至羊水收获干净。相当一部分病毒其羊水和尿囊液可以混合，如新城疫，支气管炎、法氏囊病毒等。有些有能混合，则应将两者单收、单放。

绒毛尿囊膜：如要收获整个尿囊膜，则可在消毒、打开蛋壳、撕去壳膜后，将整个卵内容物倒出，这时绒毛尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即可。

胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿放灭菌容器内即可。

6．鸡胚接种注意事项

（1）接种材料一般都应按每毫升1000单位或微克加入青、链霉素。

（2）接种位点应避开鸡胚在血管和胚头，以免针头刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。

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（3）接种点最好选在胚头左侧，因一般人均右手持注射器，注射时易往左侧倾斜，这样不易刺伤鸡胚。

（4）接种后注射口和气室孔均应用石蜡切实密封，防止细菌污染造成死亡。死亡鸡胚应随时取出，以免时间过长细菌繁殖并对周围鸡胚造成污染。

（5）鸡胚取出冷冻时应保持气室向上，否则收获尿囊液时很困难。

八、动物试验技术

动物试验常用于病原微生物的分离、鉴定、免疫原性测定、致病力测定，保护力测定、感染谱测定、病原的继代保存或致弱、中和试验、半数感染量或致死量测定以及制造疫苗和免疫血清等。下面介绍几种常用的动物试验技术。

1．常用的实验动物：兽医常用实验动物有家兔、小白鼠、豚鼠、大白鼠、鸡和鸽子等。必要时亦可使用本种动物，如猪病用猪，羊病用牛。无论何种动物均应健康无病，不带有任何病原微生物，如能使用SPF动物则更好。同时应对所试验病原体敏感。

2．动物试验技术

根据实验目的，动物试验的接种技术有皮下、皮内、肌内、腹腔、口鼻、静脉及颅内等多种方法。动物接种前必须保定、消毒、剪毛。针头的大小根据动物种类和接种部位而定。接种剂量小白鼠一般0.2毫升，大白鼠一般0.5毫升，家兔、鸡一般1～2毫升，鸽子0.5毫升。

（1）动物的保定

家兔可用保定台或保定筒进行保定，也可徒手保定。徒手保定时让其侧卧于实验台上，一手压住臀部和后腿，另一手抓住肩部和前腿。大鼠和小鼠的保定是用左手拇指捏紧双耳和颈部皮肤，手掌和其余手指握住背部。较小的豚鼠其保定方法同大鼠或小鼠：较大或怀孕的豚鼠，可用左手捏住头颈部皮肤及背部，右手固定其臀部和后肢。保定鸡或鸽子时让其侧卧于实验台，右手压住翅根部和背部，左手握住两后肢大腿部。

（2）动物接种

不同部位的接种方法如下： 皮下接种：选皮下组织疏松，便于注射和易于吸收处。一般兔和豚鼠在腹部和大腿内侧，鸡和鸽在胸部两侧，大鼠在背部或腹股沟部，羊和猪、犬在四肢内侧。注射时可于消毒后用镊子将皮轻轻夹起，在镊子下部进针注射，注射后用酒精棉球压住注射部位再将针头拨出，以防注射物流出。

肌肉接种：除禽类常用胸肌接种方法外，其他实验动物一般均为臀部肌肉接种。接种时先消毒，然后将针头垂直或稍倾斜刺入肌肉内注射。

腹腔接种：该方法常用于小鼠、豚鼠或家兔。小鼠在脐后部中线附近，消毒后将针头以几乎平行于腹中线的角度刺过皮肤和腹肌，注射时应感觉不到有阻力，否则可能在皮内或皮下。家兔和豚鼠腹腔接种时，先从腹股沟处刺入皮下，再进针约1厘米左右。进入腹腔注射。检验注射是否正确，除无阻力感外，还不应看到或摸到注射部位有鼓泡，否则可能在皮下或皮内。

静脉注射：多用于家兔接种，可选择耳外侧背部边缘静脉，用酒精棉球涂擦或以手指用力弹打耳边，可使耳静脉充血，怒涨，利于进针。消毒后左手拇指和食指紧捏静脉基部，无名指和小指夹住耳尖部，以5号针头对准静脉先垂直进入皮肤和血管，然后将针头置于与血管平行位置进针1～2厘米。轻轻抽动注射器，若有血液进入针管则说明已进入静脉，此时松开静脉基部，慢慢注入接种材料，感到毫无阻力。若针头不回血或注射时阻力较大，则说明针头未进入血管，应重新调整进针位置。注射时针管内千万不可进入气泡，否则会使兔血管产生气性拴塞而引起急性死亡。注射完毕用棉球压迫针口片该，以免出血。小鼠多采用尾

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静脉注射。

脑内接种：小白鼠、雏鸡常为脑内接种的动物。以两眼或两耳连线偏左颅骨处将4～6号针刺入脑内约1厘米深，注入接种材料0.05毫升即可。注意严格消毒。

九、病原体的鉴定方法

各种病原微生物通过分离培养后，最终都必须通过病原鉴定才能最后得出确诊或结论。病原体的鉴定一般包括如下内容：

1．形态鉴定：病原细菌主要通过涂片，染色后用光学显微镜（即普通显微镜）的高倍镜头（即油镜头）观察其形态大小、染色特性、有无荚膜、芽孢、鞭毛以及存在方式等，从而做出初步鉴定。病料中的病原体形态观察，可用各种病料组织（肝、脾、淋巴组织、血液、胆汁、气管分泌物、胃肠内容物等）涂片、干燥后，以瑞氏染色法、姬母萨染色法或美兰染色法染色镜检。培养后病原细菌可用蒸馏水稀释，涂片后，以革兰氏染色法染色镜检。具体染色方法和各种病原细菌的形态特征可参考后面有关章节内容。病毒的形态特征鉴定目前主要依靠电子显微镜观察，一般基层单位难以做到。

2．培养特性鉴定：对于细菌主要是检查其人工培养所适宜的培养基种类（普通培养基，鉴别培养基及特殊培养基等）、培养条件（ 温度、氧气及时间等）、生长特性（菌落形态、大小、色泽、粘度、光滑度、是否溶血、菌液是否混浊或有沉淀等、有无毒素产生以及噬菌体类型等）。对于病毒则主要是检查其生长繁殖所适宜的易感动物、细胞或禽胚、最佳生长条件（细胞的种类、各种营养成份及特殊成份、禽胚的种类及日龄、温度等）和生长特性（细胞是否产生病变、复制周期长短及病毒滴度出现峰值的时间、禽胚是否发生各种病变或死亡、干扰作用、血细胞吸附作用，病毒复制的部位及方式等）。具体鉴定方法可参照后面各有关章节。

3．生化鉴定：此项内容主要是针对病原性细菌，包括各种糖类的发酵试验，某些特殊物质的产生或利用试验等，具体方法可参考各章节有关内容。

4．理化特性鉴定：理化特性是病原微生物的基本特征，也是进行病原分类和鉴定的主要依据之一。

理化特性主要包括核酸类型及存在方式、G＋C含量、蛋白质多肽的含量及类型、酶的种类及含量、脂质含量、碳水化合物（糖和多糖）含量以及其他成分的含量等。除此之外，细菌还应包括抗原分析（表面抗原、鞭毛抗原、菌毛抗原、荚膜抗原、芽孢抗原、胞壁抗原及胞浆抗原等），病毒则包括沉降系数、浮密度等。理化特性鉴定均需特殊条件。

5．生物学特性鉴定：主要包括感染谱、致病力、毒力、免疫性、血凝性、生物型、抵抗力（对外界环境因素、物理化学因素、消毒药物及抗微生物药物的敏感性）等。

6．血清学鉴定：主要根据免疫学原理，利用特异免疫抗体对病原微生物进行鉴定。血清学鉴定方法包括凝集反应（试管凝集和平板凝集）沉淀反应（试管沉淀和琼脂扩散沉淀反应）、血凝抑制反应、中和反应、间接血凝、免疫电泳、荧光抗体技术、酶标抗体技术、放射免疫技术、补体结合反应、红细胞吸附及吸附抑制试验，免疫粘附血凝试验，协同凝集试验及其他抗体标记技术等。这些鉴定方法有的比较简便，如凝集反应，沉淀反应，琼扩反应，血凝抑制反应等，在本教材各有关章节中均有介绍。其他一些方法均较复杂或需一定试验条件，可参考其他教材。

7．其他鉴定方法：随着分子生物学理论和技术的迅速发展，鉴定病原微生物的方法也不断增加，而且更加特异和敏感，例如目前已进入实用阶段的核酸杂交（核酸探针）技术、体外核酸扩增技术（聚合酶链反应，PCR）酶切图谱、性酶切片段长度多态性分析（RFLP）和核酸序列测定技术等。当然，这些鉴定方法适合各种病原微生物，但一般只有在设备齐全的实验室才能进行。

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第二部分 传染病实验室诊断技术

一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术

(一)鸡新城疫(ND)主要侵害鸡，其次是火鸡、珠鸡和野鸡，鸭鹅等水禽均不易感。本病在流行上具有高度接触传染性，发病率和致死率很高。一年四季均可发病。但以春秋两季发病较多，本病临床症状表现为体温升高到木43～44℃，精神沉郁或闭眼嗜睡，病鸡腹泻呈黄白色或绿色，有时带血，常摇头、嗳气，发出“咯咯”声，口和鼻中有多量粘液，嗉囊内积液，病程稍长或呈慢性经过时，常有腿、翅麻痹或头、颈歪斜等神经症状。剖检特征病变是腺胃的乳头突起部或粘膜上有点状或斑状出血，有时形成溃疡，尤其在腺胃与食道交界部更为明显。肌胃粘膜上有点状或不正形的出血斑点。肠道、尤其是盲肠扁桃体和小肠粘膜（迥言瓣部）以及直肠粘膜上出血和不同大小界限清楚、出血性纤维素坏死伪膜，其他各部位如心、腹部脂肪及喉头、气管等处都有出血斑点。

（二）病毒分离

材料应采自早期病例，慢性病例不适宜于分离禽病毒，病鸡扑杀后应用无菌手术采取脾、肾、肝、肺（通常有较高的病毒滴度），脑（病毒的存在时间较其它组织长）或骨髓（最不易被细菌污染）等组织。生前可用灭菌棉拭子获取呼吸道或泄殖腔分泌物。将棉拭子浸出液或经研磨的组织悬液制成1:5～10乳剂，每毫升加青、链霉素各1000～2000单位，以抑制可能污染的细菌，置冰箱中作用2～4小时，然后离心沉淀，取其上清液作为接种材料。 鸡胚接种

常用9～10日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。

1．照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。 2．在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。 3．用较干的碘酊棉球涂布小孔。

4．用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，缓缓注入0.1～0.2毫升，拔出针头。

5．用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。

6．置37℃温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24小时内死亡的胚弃之）。

7．将死胚收藏于4℃冰箱内，气室向上，6～24小时获尿囊液。

鸡胚接种诸途径

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8．收获尿囊液时，以碘酊涂擦气室和气室附近的蛋壳，用灭菌摄子将气室处蛋壳敲破，剥去蛋壳，用另一灭菌小镊子剥去蛋壳膜，并撕破绒尿膜，暴露出清晰的尿囊液（混浊者已污染，应弃去不收），以镊子将胚胎和胚膜压向一边，吸取尿囊液于灭菌瓶中，并加标签。 用透明而无菌者作血凝反应，可在96孔微孔板上进行，也可将尿囊液一滴与1～2%鸡红细胞悬液一滴在一块白瓷板上相混和，如发生红细胞凝集，即用已知抗鸡新城疫血清作血球凝集抑制试验（HI），出现抑制反应，便可得到确诊。

组织培养（细胞培养）

鸡新城疫病毒能在禽源原代细胞，一些哺乳动物的原代细胞和细胞系中生长繁殖，因此也可用细胞培养的方法来分离病毒。最常用的是在玻璃和塑料容器内长成单层的鸡胚成纤维细胞。操作时可将待检液作一系列十倍比的稀释（如10-1到10-3），分别注入到鸡胚成纤维细胞的培养管中，24小时～48小时出现细胞病变（细胞圆缩颗粒化，拉长呈蜘蛛网或干枝梅样），取培养液作HA和HI试验，鉴定病毒。也可在细胞培养中用已知血清进行中和试验，作出鉴定结果，如将待检材料注入鸡胚成纤维细胞的平皿培养中（空斑试验）。新城疫强毒通常出现大而透明或大而红色蚀斑（2～4毫米）。根据蚀斑形成单位可测定病毒浓度。

（三）血清学检查

由于循环抗体产生后，病毒可从寄主的组织中迅带消失，所以慢性病例难于分离病毒，应通过特异抗体的检查来间接诊断此病。通常中和抗体较血凝抑制（HI）抗体维持时间要长些，但中和试验较费时花钱，而HI试验能在短时间内作大量测定，检出的抗体滴度一般相当于中和滴度。因此常用HI试验来检查抗体。抗体滴度于感染后5～7天开始上升，15～20天可达高峰且能维持较长时间，受强毒感染而耐过的鸡在体内产生极高的抗体水平，滴度高达11（Log2）以上。在感染群内出现高抗体的数量随鸡群原有的抗体水平而异，与鸡的年龄也有关系，平均可达30%，在只有少数出现症状，不断发生死亡的鸡群中，我们可对活鸡进行抗体检测。如有较多高抗体鸡的出现，说明鸡群已受过新城疫野毒感染。免疫过较长时间的鸡群持续保持高水平的抗体，可能是隐性感染或慢性感染的结果。

（四）鸡群血凝抑制抗体水平快速测定法 近年来养鸡业有较快发展。但由于免疫失时，免疫不当和疫苗失效等多种原因致使鸡新城疫仍有流行，一些免疫力低落的鸡群，遇野外强毒侵袭时，有的引起急性爆发招致大批死亡，有的造成隐性感染而使野毒继续潜留。这不仅给广大农户带来损失也威胁着养鸡业的进一步发展。因此，在加强预防接种同时用一种快速、简单、可靠的监测手段来了解鸡群免疫状态和有否野毒感染，以便掌握确切免疫时机，更有效地控制新城疫，是生产上急需解决的问题。

由于血凝抑制（HI）试验比中和试验简单、方便。且HI抗体水平与攻毒保护有密切关系。故HI试验仍是目前国内评价鸡群免疫状态最常用的血清学方法。但常规的试管全量法比较麻烦，不适用于较多样品的测定。本文介绍的三种简易、快速的测定方法供生产上实际应用。

β－微量法 器材

1．塑料微孔板：96孔V型凝集板，使用前后充分清洗，晾干。

2．针管定量稀释器：以四支全量0.25毫升的注射器并联制成，可以定量，前端接塑料滴头，每挤一下为0.05毫升。一次可同时稀释四个样品。然后更换干净的滴头再用。（见图）

3．微型振荡器：专用于微量凝集后的混合。也可用手振荡混合。

4．塑料采血管：内径2毫米的聚乙稀塑料管，剪成10～12厘米长，备用。

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5．标准滴管：以静脉注射管连接磨去尖端的18G号针头，要求每滴0.025毫升。 试剂

1．磷酸缓冲盐水（PBS），用作稀释液。PH7.0～7.2，配方如下： 氯化钠 170.0克 磷酸二氢钾 13.6克 氢氧化钠 3.0克

蒸馏水 1000.0毫升

高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存，用时作20倍稀释。

2．浓缩抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液经灭灭，聚乙二醇浓缩制成，其血凝价为5000～16000，用聚乙烯塑料管小剂量分装，置4℃冰箱保存备用。（可在4℃下保存10个月以上，效价不变）。

此抗原具有效价高、洗脱慢、耐长期保存和不散毒等优点，每次作血凝抑制试验按固定比例稀释配制4个血凝单位浓度的抗原，抗原稀释倍数按下式计算：

（稀释倍数=血凝效价/血凝单位数）

3．红血球悬液，采成年鸡血放入加有8％柠檬酸钠抗凝剂的试管中或等量Alsever液中（后者可在4℃下保存2周），用20倍量的PBS洗涤血球，重复3～4次。每次2000转、分离心5分钟，最后一次离心10分钟，吸取压积血球，用PBS配成0.5％悬液，或先配成10％浓悬液（可在4℃下保存2～3天）用时进行20倍稀释。

4．标准阳性血清：采自高度免疫的公鸡，经效价测定后分装小瓶，且在瓶签上标明HI价，0℃冰箱存放待用。

5． 待检血清：检测鸡群免疫水平时，每群随机采血20～30份血样，先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6～8厘米长度。在酒精灯上将管一端烧融封口，或用石蜡封口，

用胶布标明鸡号或群号，置37℃温箱中．2小时，待凝固拆出血清后以1000转／分离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，如需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去。滴融化石腊封口，冻存于0℃冰箱内，用这种方法采血简易、快速、对鸡损伤小，尤适于雏鸡采血，也便于采血后携带，存放和分离血清。

试验操作

1．微量血凝(HA)试验

(1)用定量稀释器于每孔中加PBS0.05毫升，共滴4排孔。

(2)以稀释器吸1:5稀释抗原于第一列孔，挤压4～6次混匀后吸至经二列孔，依次倍比稀释，最后一列不加抗原作为对照。

(3)换去稀释器前端塑料管头，再吸0.5％红血球悬液依次加入各孔，每孔0.05毫升。 (4)置微型振荡器上振荡1分钟，或以手平持血凝板绕圆圈混匀。 ’ (5)置室温下(18～20℃)30～40分钟，根据血球凝集图象判定结果。

以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度，如用2为底的对数表示，则1代表第1个稀释度(5×21)，2代表第2个稀度(5×22)，依次类推，其血凝滴度恰与板上出现完全凝集的最高孔数一致，(为精确比较不同抗原的血凝滴度，可将最高凝集孔后一孔的不全凝集状态：25％、50％、75％的凝集分别以对数0.25、0.5、0.75表示，作为前面整数的尾数)。每次做四个重复以几何均值表示结果。

2．β—微量HI试验

(1)在96孔V型微孔板上进行，用针管定量稀释器加样和稀释，一次可同时稀释四个样品。

(2)先取PBS0.05毫升，放入第l孔和第12孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加

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入3～11孔，每孔0.05毫升，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原0.05毫升。

(3)用稀释器吸待检血清0.05毫升于第l孔中(血清对照)挤压混匀后吸0．05毫升于第2孔依次倍比稀释至第11孔，最后弃去0.05毫升。

(4)置室温(18～20℃)下作用20分钟。

(5)用稀释器滴加0.5％红血球悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置30～40分钟，判定结果。

以完全抑制血球凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，如用以2为底的对数(Log2)表示，其HI滴度恰与板上出现完全抑制的最高孔数一致。(为精确比较不同样品的HI滴度，可将最高抑制孔后一孔的不全抑制状态，25％、50％、75％的抑制分别以对数0.25、0.5、0.75表示，作为前面整数的尾数)。

注意事项 1．本法具有简易、快速、重复性好等优点，测得的HI值比标准全量法平均高0.65(Log2)。 2．血凝和血凝抑制试验虽简便、快速，但影响因素甚多，有时测得的结果不一致。因此必须严格控制试验条件，如准确配制红血球悬液和4单位浓度的抗原，每次测定应有严格的温度范围和作用时间等，鉴于影响因素广泛，可变，每次测定应设已知滴度的标准阳性血清作对照。

3．攻毒试验表明，HI滴度在4(Log2)的鸡保护率为50％左右，在4(Log2)以上的保护率 达90％～100％，在4(Log2)以下的非免疫鸡保护率仅9％，免疫过的鸡为43％，鸡群的HI抗体水平以抽检样品的HI抗体几何均值表示。如平均水平在4 （Log2）以上，表示该鸡群为免疫鸡群。

4．当鸡群受到野外强毒侵袭时，总有一些个体能耐过感盛而存活，同时产生极高的抗体水平，用微量法在鸡群中检测时，如有较多11（Log2）以上的高抗体鸡出现，说明鸡群已受新城疫强毒感染，在必要时，可利用检出的高抗体鸡的高免血清对那些刚发病或受到威胁的鸡群进行紧急被动免疫，可以减少死亡，以利迅速控制流行。

表5 微量血疑（HA）试验 穴号 滴度材料 PBS（滴） （约0.05ml） 抗原 （滴） 0.5％红血球悬液（滴） 1 5×21 2 5×22 3 5×23 4 5×24 5 5×25 6 5×26 7 5×27 8 5×28 9 5×29 10 5×210 11 5×211 12 对照 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 弃去一滴 1 1

全血平板法 主要材料 1．器材：白瓷板，标准滴管(以静脉注射滴管连接磨去尖端的18号针头，要求每滴0.025毫升)，三用血色素管、三棱针、酒精灯等。

2．抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液经灭活、聚乙二醇浓缩制成。使用时用PBS稀释至含32～血凝单位的浓度。每10毫升稀释抗原中滴入10％柠檬酸钠0.1～0.2毫升。(稀释抗原能在4℃下存放4～5天)。

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3．阴性鸡：未经任何免疫，用β一微量法测定其HI滴度在1:16以下。 操作方法

先在白色瓷板上划好4×4厘米方格。以标准滴管加已稀释好的抗原于方格内，每格4滴(约0.1毫升)。然后刺破翅下静脉或鸡冠，用三用吸管吸取全血10微升于抗原液中充分搅拌混合使之展开成直径3厘米大的液面。作用1～2分钟后判定。

结果判定

根据血球凝集程度记录结果：“2”表示2分钟内100％凝集，血球凝集呈花斑状或颗粒状，背景澄清，判为阴性(无抗体)。“1”表示部分凝集。2分钟内出现微量细小的凝集颗粒，背景不全清亮。具有程度不一的流动血液，判为可疑。“0”表示2分钟内不凝集。即100％抑制，血液与抗原均匀一致，判为阳性(有抗体)。

注意事项

1．浓缩抗原一经稀释在野外条件下会受到阳光、温度、污染等多种因素影响，稳定性降低，故抗原应现用现配，当天用完或一次稀释后存放4℃冰箱中，使用时倾出少许，五天内用完，在大批鸡检验前。需用标准阴性鸡预试，以保证抗原效价稳定，检查准确。

2．平板HI试验受温度影响，气温低于9℃凝集缓慢，反应不充分；高于30℃洗脱加快，且易干燥，影响判定。本实验宜在12～28℃下进行，反应比较稳定。

3．全血平板HI试验阴性鸡，其HI滴度相当于1～3(Log2)，攻毒后多数不保护；阳性鸡其HI滴度相当于5(Log2)以上，攻毒后90％以上保护；可疑鸡其HI滴度相当于4(Log2)左右，攻毒后半数左右保护。用平板法在现场监测鸡群免疫水平时，鸡免疫后一定时间的鸡群随机检测10～30只鸡，如出现半数以上的阴性鸡时，表明其免疫水平已处于临界水平之下，急需再次免疫以迅速提高鸡群抗体水平。平板法用于HI水平的定性测定，便于在技术条件较差的中小鸡场和专业户小群养鸡现场应用，虽不如微量法精确，但操作简易快速。

卵黄HI试验

用卵黄测定HI抗体，方法简便，操作时先在蛋壳上打一蚕豆大孔，放尽蛋清，用1毫升注射器(不带针头)插入卵黄中吸取0.5毫升于等量中性磷酸缓冲盐水或8％构缘酸钠或16％NaCl液中，混合后即可按血清β一微量法测定HI滴度，判定时为避免卵黄的影响，可从微孔板反面观察凝集图形。由于凝集图型在卵黄液中洗脱较快；故应及时判定。

本法可利用破壳蛋、畸形蛋或无精蛋。尤适于蛋鸡、种鸡场应用。卵黄抗体与产蛋时种鸡血清抗体一致，与同一时期入孵的雏鸡抗体相比平均高1个滴高，因此用卵黄测定HI抗体可避免捉鸡采血对鸡群的不良影响，还可通过测定同时了解种鸡和出壳雏鸡的抗体水平；以预测雏鸡初次免疫最适时间。

二、产蛋下降综合征的诊断及抗体检测 、

产蛋下降综合征(EDS～76)是近年来传入我国的一种新病，主要危害产蛋鸡。其病原是一种腺病毒，来自于鸭，但只危害鸡。该病毒可凝集鸡，火鸡和鸭的红细胞，并在鸭胚尿囊液或细胞培养液中有很高的血凝价，因此可用血凝(HA)试验和HI试验检测病毒及其抗体。鸡感染本病毒后常无明显临床症状，仅表现突然产蛋下降，持续3周以上；产蛋下降幅度在30～50％之间。同时产软壳蛋，蛋壳颜色变浅，畸形蛋可达10％以上。一旦发病，产蛋率很难达到高峰或恢复到发病前水平。本病亦无特征性病理变化，因很少发生死亡。因此本病的诊断主要依靠血清学和病原学方法，同时结合流行病学和临床症状。

(一)血清学诊断：主要包括HI抗体和琼扩抗体的测定

1．血凝抑制试验(HI)：除了抗原用EDS～76病毒鸭胚尿囊液、阳性对照血清用EDS76

疫苗高度免疫过的鸡血外，其它所用试剂和操作方法均与鸡新城疫的血清HI试验相同。当被检鸡的HI价达1:16 以上时即可判为阳性。

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2．琼扩试验：本法即可用于检查病原，又可用于测定抗体。检查病原时先将病料接种于10日龄鸭胚，培养96小时后收取鸭胚尿囊液，然后与已知EDS～76阳性血清作琼扩反应，检查抗体时用已培养好的病毒尿囊液作抗原，然后采待捡鸡的血清与抗原作琼扩反应，琼扩试验时，应有巳知病毒抗原和阳性血清作对照，当对照孔出现沉淀线时，待检孔也出现了沉淀线．则判为阳性。待检孔不出现沉淀线则为阴性。琼扩试验所用的其他物品及操作方法与马立克氏病血清琼扩完全一样，可参考马立克氏病琼扩试验一节。

(二)病原学诊断方法：主要是病毒的分离和鉴定。取症状明显鸡的输卵管组织，研碎后用生理盐水1:10稀释；加入青链霉素，然后接种10日龄鸭胚或鸡胚成纤维细胞，若鸡胚接种需培养96小时左右，细胞培养则需72小时左右。连续盲传2～3代；然后作HA试验和HI试验或琼扩试验对病毒作出鉴定。

三、鸡马立克氏病琼脂扩散试验

鸡马立克氏病(MD)是由马立克病泡疹病毒引起的一种传染病，以淋巴细胞增生和肿瘤形成为特征，在鸡的疾病中，马立克氏病是危害最大的疾病之一，鸡群受到感染后，陆续患病，引起大批死亡．常常给养鸡业带来巨大的经济损失。

国内外用琼脂扩散试验检疫马立克氏病，实际应用表明该法简便易行、毋须特殊设备、基层兽医单位，鸡场及养鸡专业户均可采用，是一种较为理想的诊断检疫马立克氏病的血清学方法。其具体操作方法如下：

(一)试验材料 试验用品

塑料采血管、三棱针、打孔器、滴管、平皿、玻璃棒、烧杯、镊子、蚊子、酒精灯和带盖瓷盘、琼脂及含8％氯化钠、PH7.2～7.4的磷酸盐缓冲液等。

抗原

鸡马立克氏病羽囊抗原的制备：将病鸡皮肤呈现红肿感染处的羽毛从贴近皮肤处剪掉，剪下带有羽囊的皮肤，称重，加入二倍量的PH7.2的磷酸缓冲盐水研磨。-20℃冰结后，再经37℃融化，如此反复冰融4次。rpm25000离心15分钟，上清液加入0.01％硫柳汞防腐。置低温保存备用．马立克氏病羽囊抗原也可向生物药厂购买。

血清

鸡马立克氏病阳性血清的制备：用已知标准马立克氏病羽囊抗原或通过剖检和组织检查确诊为马立克氏病病鸡群，自病鸡拔下新羽毛若干、剪下羽囊，约5毫米长为抗原。由病鸡群挑选慢性病鸡或康复鸡采取血清。与羽囊抗原作琼脂扩散试验，如出现清晰沉淀线，则为马立克氏病阳性血清，采血分离血清，加0.01％硫柳汞防腐、冰结或4℃保存备用。马立克氏病阳性血清也可向生物药厂购买。

(二)操作

琼脂板的制备：用含有8％氯化钠的磷酸缓冲液配制的1％的琼脂溶液加热溶化后倒入平皿中，制成2～3毫米厚的琼脂板，平置室温凝固。

打孔：用打孔器(直径2～3毫米金属小管)按座标纸上面好的七孔图案，照图案固定位置打7个孔，打一个孔，孔径为3毫米，外围打6个孔，孔径为2毫米，孔与孔的距离为3～4毫米，如直接以羽囊作试验，则无须打抗原孔。

抗原及血清的添加

l．用标准抗原检测未知抗体(被检鸡血清)

(1)用带胶乳头滴管将受检血清顺序逐个地滴加于外周2、3、5、6孔内，加入阳性血

清于1、4孔内，每加一份受检血清前，必须把吸管充分洗净拭干。

(2)在外围孔滴加受检血清完毕后，用另一滴管向孔滴加标准抗原。

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(3)加样完毕平板加盖，在室温静止片刻，待加样稍吸附下沉后平放在铺有数层湿纱布的带盏瓷盘中，置37℃条件下，进行反应，逐日观察三天，并记录结果。

2．用已知马立克氏病阳性血清检测未知抗原(被检鸡的羽囊） (1）羽囊琼脂扩散试验，用镊子镊取羽囊（约5毫米）。尖端向下，插入抗原孔的位

置上，一处一根，一只鸡用6根(见图)；孔滴加已知阳性血清。

(2)孔囊浸液琼脂扩散试验：选拔受检鸡含羽囊丰满的羽毛10根以上，将带有羽髓的

毛根剪集于三分管内，每管加入0.5毫升磷酸缓冲盐水，用玻璃棒将羽毛根压集于管底，以适当压力转动玻璃棒10多次，待浸提液混浊后，用吸管将其移入外周孔内，一个检样滴一个孔，孔滴加巳知阳性血清。

加样完毕后其沉降作用同1。 (三)判定

1．阳性：如果受检血清内含有马立克氏病特异抗体或受检羽髓内含有马立克氏病特异抗原，则抗原和抗体孔之间或血清孔与羽囊之间出现一条清晰致密沉淀线，即为阳性，在羽囊琼脂扩散试验中，一只鸡的6根羽囊如有一根出现沉淀线，即判为阳性在羽囊琼脂扩散

2．阴性：当抗原和抗体孔之间或血清与羽囊之间不形成沉淀线者，则判为阴性。 (四)注意事项

1．对剪集的雏鸡羽髓根或羽髓含量较少的羽根，需加少量磷酸缓冲盐水浸提。水量

不宜过多。以防由于稀释而影响反应结果。

2．在滴加已知材料或未知材料时，均以加至平满为宜；过少则降低反应效果；过多

则易出现加样连片。

3．琼脂板孔打毕后，将琼脂板底面在酒精灯上稍微加热封底。

4．在处理和滴加每份受检样品前，必须将玻璃棒和滴管彻底冲洗拭干。

5．处理或使用过的受校样品可放在普通冰箱内，以备必要时复检用，待判定结果无

误时废弃。

6．马立克氏病抗原和血清等诊断试剂需低温保存，以防降低效价。 (五)溶液配制

1． PH7.2磷酸缓冲液 磷酸缓冲液原液

(1)磷酸二氢钾(KH2P04)9.078克加蒸馏水至1000毫升。 取(1)液 27毫升 (2)液 73毫升 氯化钠 8克

2． PH7.2磷酸缓冲生理盐水(PBS) 取(1)液 27毫升 (2)液 73毫升 氯化钠 0.8克

四、鸡传染性腔上囊病琼脂扩散试验

鸡传染性腔上囊病（IBD）1957年首次在美国特拉华洲甘布洛（Gumbro）城发现。

因此又称“甘布洛鸡”，是鸡的一种病毒性传染病。病鸡表现腔上囊和肠道炎症以及肾脏病变，主要侵害雏鸡幼龄鸡。本病世界各地均有流行，对雏鸡的培育威胁极大。我国近几年来本病严重流行，并分离出了该病病毒。

目前，本病检疫诊断较为快速简易、准确特异的方法是琼脂扩散试验，操作方法介

绍如下：

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1．试验用品

塑料采血管、打孔器、滴管、平皿、烧杯、酒精灯、琼脂、带盖瓷盘、氯化钠、苯

酚、蒸馏水等。

2．抗原

对传染性腔上囊病抗原的制备：用标准毒力的腔上囊病病毒株鸡体传代腔上囊，按1：

4磷酸缓冲生理盐水（PBS）制成组织匀浆，经口和眼内感染3～5周龄易感鸡。每只约0.2毫升，接种鸡发病后采取72小时的病变腔上囊，加入PBS液制成匀浆，使细胞内病毒充分释放出来。再以冻融两次裂解，1000转/分离心60分钟，取上清液加适量卡那霉素分装，-20℃保存，也可向生物药厂购买。

3．血清

检验用的鸡传染性腔上囊病阳性血清的制备：用标准毒株连续三次间隔10～15天接

种易感鸡（剂量和方法同上），待发病后的恢复期采血测定抗体效价，凡经1:以上稀释仍与抗原出现明显的沉淀线者为合格，感染鸡由心脏采血，分离血清，-20℃保存，也可向生物药厂购买。

（二）操作

1．琼脂板的制备（也可用马立克氏病琼扩试验的琼脂板代替）：琼脂1克，氯化钠8

克，苯酚0.1毫升，蒸馏水或无离子水100毫升溶化后，用5.6 NaHCO3调至PH6.8～7.2，将溶化均匀的琼脂倒入干净的平皿，制成厚度3毫米的琼脂板，冷凝后加盖置普通冰箱，可供一周内使用。

2．打孔：用打孔器（直径2毫米 和毫米薄壁圆型金属小管），在座标纸上画好七

孔图案，把座标纸放在带有琼脂的平皿下面，照图案在空位置打孔，将切下的琼脂吸出或用针头挑出，外周孔径为2毫米，孔径为3毫米，孔间距3毫米，如图所示。

3．抗原及血清的添加：孔7加入抗原0.02毫升。1、4孔加入阳性血清，2、3、

5、6孔各加入受检血清，添加至孔满为止，待孔中液体吸干后将平皿倒置，在37℃条件下进行反应，逐日观察三天，并记录结果。

（三）判定

阳性：当检验用标准阳性血清和抗原之间有明显致密的沉淀线，或者阳性血清沉淀

线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。

阴性：受检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的受检血

清孔伸直或向其外侧偏弯者，此受检血清判为阴性。

（四）注意事项

1．对琼脂板打孔时，吸出或用针头挑出切下的琼脂，注意不要使琼脂与平皿脱离，

以防止加样后下面渗漏，若琼脂与平皿脱离可在酒精灯上稍稍加热封底。

2．溶化的琼脂倒入平皿时，注意不要产生气泡。

3．受检血清要求不和不溶血，勿加防腐剂和抗凝剂。

五、鸡传染性喉气管炎的诊断

传染性喉气管炎（ILT）是由病毒引起的鸡的一种急性呼吸道传染病，其特征是病鸡

显现呼吸困难，咳嗽和咳出含有血液的渗出物。病变主要发生在喉头和气管部分，气管粘膜肿胀，出血和形成糜烂，本病传播很快。死亡率也很高。急性的可以在几天内死亡。或是经过较长的病程而痊愈。全国各地均有本病流行，危害严重，现将该病诊断方法介绍如下。

1．临床学诊断

临床学诊断对急性病例很有价值，因为急性病例常有特征症状；如鼻孔有分泌物和呼吸时发出湿性罗音。继而咳嗽和喘气，严重病例呈现明显的呼吸困难。咳出带血的粘液，有时

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死于窒息。检查口腔时，可见喉部粘膜上有黄色凝固物附着，不易擦去。另外病鸡眶下窦肿胀，持续性鼻液，分泌物增加和出血性眼结膜炎，病程继续发展，病鸡迅速消瘦，鸡冠发紫，有时排绿色稀粪，衰竭死亡。病程5～7天或更长。

有些比较缓和的病例，其症状只限于生长迟缓，产蛋减少，流泪，结膜炎，临床不易诊断。

2．病理学诊断

病鸡有特征病理变化；多见眼睑肿胀，发结膜充血、出血或溃疡，眶下窦肿胀，内有干酪样物，鼻腔、鄂裂有黄色粘液或干酪样物，部分有出血性粘液；喉头、气管粘膜充血、出血，有黄色粘液，气管内有条索状干酪样物，血凝块或鲜血，具有诊断意义。

3．检查核内包涵体

在疾病的早期（1～15天），气管或眼结膜组织切片，姬姆萨氏染色，有57%的病例可以检查到核内包涵体，借此可以帮助诊断本病，注意在固定时须用较低的PH值。

4．动物接种试验

用病鸡的气管渗出物或组织悬浮液，气管内接种（或喉头涂擦接种）易感和免疫的两种小鸡，假若易感小鸡发病，而免疫过的小鸡不发病，即可证明是本病。

5．鸡胚接种试验 取典型病鸡的喉头、气管连同分泌物于乳钵内剪碎研磨，并加5～10倍的灭菌生理盐水稀释后，经灭菌棉花纱布过滤，按每毫升悬液加入青霉素、链霉素各20000单位，置冰箱内作用4小时，然后接种于9～12日龄鸡胚的绒毛尿囊膜上。每胚0.1～0.2毫米，3～5天鸡胚死亡，剖检可见绒毛尿囊水肿，增厚，有灰白色的坏死斑和核内包涵体。

另外，将病毒接种于鸡胚肾细胞单层培养基上，24小时内可检出多核细胞，核内包涵体和坏死组织所组成的病例，此法也是重要的诊断方法。

6．琼扩试验

此方法具有检出率高、特异性强、快速等优点，方法如下： 高免血清的制备

（1）兔抗传染性喉气管炎高免血清：取六月龄体重五市斤以上健康家兔将差速离心提纯的抗原液（即传染性喉气管炎病毒鸡胚肾细胞培养物）加等量弗氏完全佐剂抗原，第一次1毫升完全佐剂抗原，两后足掌各0.2毫升，腹股沟，腹下，颈下部两侧各0.1毫升，三周后，追加差速离心提纯的水剂抗原1毫升，三天后再用G200提纯的抗原加强免疫，隔天一次，每次1.5毫升，共五次，头两次皮下分点注射。后三次静脉注射，每兔于末次注射后10天心脏采血，分离血清分装。

抗血清非特异抗体的吸收：为了除去非特异性抗体，于抗血清中加入正常的鸡胚肾细胞培养液为3:1加入，置37℃水浴。每10分钟振摇一次，一小时后转入普通冰箱过夜，次日以每分钟4000转离心沉淀10分钟，同法重复处理共二次。

（2）鸡抗传染性喉气管炎高免血清：取56日龄健康鸡，先用G80株弱毒疫苗作基础免疫，12天后气管接种0.1毫升毒价为105半数鸡胚感染量（EID50）/0.2ml的VINELAND强毒。四天后再以同法接种强毒，再过5天改用上述强毒肌肉注射，每次2毫升，隔天一次，于最后一次免疫后13天心脏采血，分离血清，以上高免血清可从生物药厂购买。

待检抗原的制备

（1）气管分泌物，从患病鸡喉头、气管刮取分泌物，待检。

（2）鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）抗原；将感染性喉气管炎病毒的CAM充分研磨，加入1倍的生理盐水经4000rpm离心15分钟，取上清液，并以正常生长相同日龄的鸡胚CAM作对照。

双向琼扩反应

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配制琼脂板：琼脂糖1.25%，氯化钠3%，叠氮钠0.02%，上述物质溶于0.04mph7.2的巴比妥缓冲液，若配制兔抗血清琼脂板，则将氯化钠改为0.85%，其余不变，孔的直径6毫米，深3毫米，孔距3毫米，加样后，置湿盒中，放于37℃或室温中，24小时观察沉淀线反应结果。

注意事项：

（1）抗血清作2～4倍稀释。

（2）抗原（被检物）太浓时，可加时防腐剂和生理盐水。 （3）反应温度：置室温或37℃湿盒中进行。 （4）制高免血清的鸡最好是来自SPF鸡群。

六、传染性支气管炎的诊断

传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性，高度接触性呼吸道传染病，病原是鸡传染性支气管炎病毒，是冠状病毒科的代表株。幼龄鸡感染发病后主要表现呼吸困难，气喘、咳嗽，气管罗音，打喷嚏等，死亡率较高。特别是目前流行的肾型传支造成的损失很大。成年鸡感染后主要表现产蛋下降，产软壳蛋、畸形蛋、蛋清稀薄如水样，很少死亡。现将本病的诊断措施简要介绍如下。

1．现场综合诊断：包括流行病学、症状和病理变化等内容。雏鸡感染后发病较多、有典型的呼吸道症状，剖检变化以气、支气管有粘液或干酪样物质、粘膜水肿、气管下段及支气管病变严重、气囊混浊为主要特征，有时可见局灶性肺炎。肾型传支死亡较快，死亡率高，死前除呼吸症状外，还可见拉白色石灰渣样物质。成鸡感染后主要表现产蛋下降和产畸形蛋，偶尔可见拉黄、绿色稀粪，很少死亡。另外目前还有一种所谓腺胃型传支。

2．病毒分离与鉴定：取发病初期症状严重的雏鸡气管、肺、肾或产蛋鸡的输卵管和泄殖腔，制成1:5无菌悬液后接种9～10日龄鸡胚尿囊腔或鸡胚气管环培养物，48～72小时后收获含毒培养液，再如此传代3～4次，根据鸡胚死亡情况，胚胎特殊病变及气管环纤毛摆动情况对病毒作出初步鉴定。然后将病毒与已知阳性血清作鸡胚中和试验、琼扩试验，并将病毒接种易感鸡进行动物回归试验，从而对所分离病毒作出鉴定。

3．血清学诊断：本病毒血清型很多，有群特异性和型特异性诊断方法。ELISA、荧光技术和琼扩试验是检查群特异性的方法，足可作出诊断，但不能鉴定血清型。病毒中和试验和HI试验可用于型特异性鉴定，但必须使用初次反应抗体。由于本病的抗原较难制备，因此无论哪种血清学方法都不易在实践中广泛应用。其中琼扩试验虽最简便，但抗体持续时间短，因此结果不规律，从而可能出现假阴性。其操作方法与法氏囊琼扩相同。

七、包涵体肝炎的实验诊断

包涵体肝炎（IBH）是由鸡腺病毒引起的鸡的以肝脏受害为主并在肝细胞中形成核内包涵体为特征的传染病。该病毒可在鸡胚及多种细胞中生长。本病多发生于1～2月龄雏鸡，且肉鸡多见。病鸡主要表现精神沉郁、食欲减退，头部苍白，突然死亡。多呈散发，持续时间较长，总死亡率可达30%左右。其实验室诊断方法如下：

1．病理剖检：

肝肿大、有出血点、斑，或有坏死灶。肝表面不光滑，颜色变淡呈淡褐色或黄色，质地脆弱。病程长者肝萎缩。继发细菌感染则有肝周炎。胸肌、腿肌、皮下、脂肪、肠浆膜面有出血。有时可见法氏囊萎缩、脾肿大、肾肿大等病变。

2．显微镜检查：肝组织切片经H·E染色，可在肝细胞中见到包涵体，既有明亮的圆

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晕状嗜酸性包涵体，也有浓染的块状或颗粒状嗜碱性包涵体。自然病例只能见到嗜酸性包涵体。有包涵体的核比正常的细胞核大，特别是有嗜碱性包涵体者其核可变大2～3倍。

3．病原学检查：用病死鸡的新鲜肝脏1:5稀释的无菌悬液，rpm4000离心5分钟，取上清加青、链霉素后接种10日龄鸡胚尿囊膜。接种后5天左右胎儿死亡，表现全身出血，肝脏有坏死斑。另外也可将病料悬液接种鸡肾细胞，鸡胚成纤维细胞或肝细胞，接种后2～3天出现圆形细胞病变。还可将病料接种一周龄内的小鸡，2～7天后出现死亡，肝脏有小坏死点及出血，不死者1～3周后表现贫血。

4．血清学诊断：琼扩试验最常用，主要检查感染鸡群的血清抗体，进行流行病学调查及诊断，但不能区分血清型。其操作方法与马立克氏病血清琼扩方法相同，只是抗原不同而已。

八、禽脑脊髓炎的实验室诊断

禽脑脊髓炎（AE）也是一种由病毒引起的侵害家禽中枢神经系统的传染病，主要侵害雏鸡，表现共济失调，后肢麻痹和头颈震颤。蛋鸡表现产蛋量下降。我国近年来已开始流行。其实验室诊断内容主要是病毒分离和血清琼扩试验。

（一）病毒分离 无菌采取发病后2～3日、症状典型的鸡脑，研磨后用生理盐水制成1:10匀浆，rpm1500离心30分钟，吸取上清加入青链霉素，4℃作用4小时。用无AE母源抗体的5～6日龄鸡胚卵黄囊接种，每胚0.2毫升。接种后10～12天鸡胚可发生麻痹而不运动，有时死亡。不死的鸡胚可孵出小鸡，但这些小鸡多在10日龄左右出现典型的AE症状。

另外还可接种鸡胚各种细胞组织或对一日龄雏鸡脑内接种。 （二）血清琼扩试验：用鸡胚尿囊毒制备抗原可与阳性血清及自然感染后的病鸡血清作琼扩试验。此法既可检查病毒抗原，也可检查血清中抗体，简便易行。其操作方法与马立克和法氏囊病琼扩试验相同。

九、鸡传染性贫血的实验室诊断

鸡传染性贫血（CAA）是一种新发现的鸡传染病。80年代在部分国家开始流行，我国目前也已有本病流行。本病的病原是鸡传染性贫血因子（CAA），其分类地位为环状病毒科。

本病目前还无较实用的简便诊断方法，有条件时可作下列实验室诊断。

1．病毒分离：取病鸡肝脏用PH7.4的PBS制成20%匀浆，冻融3次，prm1500离心10分钟，取上清70℃灭活5分钟，再用10%氯仿室温处理15分钟，经450纳米滤膜除菌后，接种MDCC－MSBI细胞，观察细胞病变即可确诊。

2．中和试验：将病料悬液与CAA阳性血清按不同稀释倍数混合后接种细胞然后观察细胞病变，计算中和指数。同时设有阴性血清和空白对照。

除上述诊断方法外，目前还建立了荧光抗体和ELISA方法，但还都不易于推广应用。本病目前尚无疫苗可用。

十、禽霍乱的诊断

（一）禽霍乱（Cholera Avium）主要侵害鸡、鸭火鸡、鹌鹑、野鸡、海鸥、麻雀等。在高温潮湿的夏季和气候剧变的春秋雨季发病较多。本病最急性病鸡常见突然发病，倒地死亡，有时在采食或产卵时死亡。肥胖和高产鸡多见。急性病鸡表现体温升高达43℃以上，无食欲，缩颈闭眼，剧烈腹泻，排出黄色，灰白色或绿色稀粪，口、鼻有粘液，鸡冠和肉垂发紫，慢性病鸡表现消瘦、贫血、关节肿大、化脓或呼吸困难。鸭和鹅本病症状与鸡相似，病理剖检特征变化，可见皮下组织和腹部脂肪常有出血小点，肠道发炎，以十二指肠的病变

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最显著，粘膜充血，红肿，有数量不等的出血点，表面有多量的黄白色粘液。肠内容物中含有血液，肝脏肿大，色泽淡黄许多灰白色尖针头大的坏死灶。

（二）禽霍乱的微生物学诊断

1．采取材料：病死鸡群新鲜尸体。 2．涂片、染色、镜检：

用病死鸡心血、肝、脾涂片，待自然干燥后，用瑞氏染色法（或美兰染色法）染色，水冲洗待干后，用油浸镜头镜检，多杀性巴氏杆菌呈卵圆形，有明显的两极性染色，并可清晰地看出两极之间两则的连线，两极性菌呈兰色或淡青色。而鸡红细胞染成淡红色，呈椭圆盘状，细胞中含有紫色的核。

3．分离培养

将病料分别无菌操作接种于鲜血琼脂、血清琼脂、普通肉汤，麦康盖培养基上，放入37℃恒温箱中培养24小时后，观察培养结果，多杀性巴氏杆菌具有下列特点：

（1）在鲜血琼脂平皿上可长成湿润的水滴样菌落，菌落周围不溶血。

（2）在血清琼脂平皿上长成淡灰白色，露珠样小菌落。表面光滑闪光边缘整齐。菌落具有特殊的荧光性。菌落于45度折射光线下检查可见有不同色泽的荧光，如F0型的菌落较大，呈现桔红色带金光，边缘乳白色光带，禽巴氏杆菌绝大多数是F0型，少数可见到Fg型的菌落，呈现兰绿色而带金光，边缘有狭窄的黄红光带。

（3）在普通肉汤中24小时培养呈均匀混浊，放4～5天后，于管底生成粘稠沉淀，振摇时沉淀物呈辫状升起。

（4）生化试验

用纯培养物进行靛基质试验、胆汁试验，接种于葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、卫茅糖、鼠李糖培养基，37℃培养48小时观察结果，多杀性巴氏杆菌生化试验特性见下表：

表8 多杀性巴氏杆菌的主要生化特性表 运动力 － 靛基胆汁菌落45度折光检试验 试验 验 ＋ － 呈兰绿色或桔红色荧光 葡萄糖 A 甘露醇 A 蔗糖 A 卫茅糖 A 乳糖 － 鼠李糖 － 麦芽糖 － ± 注：A表示发酵；－表示不发酵；±表示不稳定。 5．动物试验

将病为研磨成糊状，用灭菌生理盐水稀释成1:5～1:10乳剂，也可用肉汤孵育24小时纯培养物或心血接种于实验动物（鸽、鸡或小白鼠）剂量为0.2毫升，皮下或肌肉注射。（小白鼠可以腹腔注射）。实验动物可于接种后18～24小时呈败血症状死亡，可再采取心血及实质脏器作抹片检查，或分离培养。最后，根据以上检查病原菌形态、染色、培养特征、荧光、生化等特性加以鉴定。

附：禽霍乱微生物学诊断程序

被检材料

涂片染色镜检 血液脂培养 动物接种试验

肉汤培养

麦康盖琼脂培养 生化试验

十一、鸡白痢的检疫

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鸡白痢（Pu I Ioresis）是由鸡白痢沙门氏杆菌引起的鸡的常见传染病，主要侵害雏鸡，可引起大批死亡。在成年鸡中多属慢性经过，并可经病鸡所产卵传染下一代。构成连续的传染链锁。本病目前尚无有效的免疫方法。只有采取有计划的检疫，及时淘汰带菌鸡民综合 性卫生防疫措施相结合，才能控制或消灭此病，血清学检疫的方法有全血平板凝集反应，血清平板凝集反应，卵黄平板凝集反应和卵黄（血清）琼扩沉淀反应等。

（一）快速全血平板凝集反应 1．主要材料

（1）器材：玻板（洁净无油脂）、滴管（每滴约0.05毫升）采血针、铂金耳等。 （2）抗原：多价抗原（加有0.1%结晶紫）用鸡白痢沙门氏杆菌培养物加甲醛溶液杀菌制成（每毫升含菌100亿）。静置时呈紫色液体，瓶底有沉淀物，振荡后成混浊的悬浮液。由兽医生物药品厂供应。

（3）阳性血清：均由兽医生物药品厂供应。阳性血清凝集价应不低于1:1600（＋＋）。 2．操作方法：先将抗原充分振荡均匀，用滴管吸取抗原垂直滴一滴（约0.05毫升）于玻板上。随即用针头刺破被检鸡的翅静脉或鸡冠出血，以灭菌铂耳（环径约4～5毫米）取血满环（约0.02毫升）放于抗原上，用铂耳搅拌均匀。并摊开至直径2厘米为度。静置待判定。每次试验时，均需有阳性血清对照。

3．结果判定

（1）抗原和血液混合后，在2分钟内出现明显的颗粒凝集或块状凝集为阳性（＋）反应。

（2）在2分钟内不出现凝集，或仅呈现均匀一致的细微颗粒。或在边缘处由于临干前形成有细絮状物等均判为阴性（－）。

（3）上述反应以外，不易判为阳性或阴性的，判为可疑。 4．注意事项

（1）本抗原保存于8～10℃冷暗干燥处，用时要充分振荡均匀。

（2）作凝集反应最好在20℃左右气温中进行，气温过低反应时间略长。

（3）采血针与铂金耳每次使用都要用酒精棉球擦去血液或火焰上烧灼后，再采取第二只鸡的血液。

（4）鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏杆菌具有相同的“O”抗原，故成年鸡感染鸡伤寒检疫时也出现阳性反应。

（5）本抗原只适用于产蛋母鸡和一年以上的公鸡，对幼龄鸡敏感度较差。 （二）血清平板凝集反应 1．主要材料：

（1）抗原：与全血平板凝集反应相同。

（2）待检血清：以内径2毫米，长10～12厘米的聚乙烯塑料管引流采血，先用三棱针刺破翅下静脉，立即用塑料管引流血液至6～8厘米长度，在火焰下将管一端烧融封口，用胶布标明鸡号，置37℃温箱中2小时，待血清析出后以1000转/分钟离心3～5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板孔中。

（3）其它用具：用一块玻板以蜡笔按约1平方寸划成若干方格，一个方格检查一只鸡的血清样品。若有条件可做成一个木箱，将玻板放于木箱顶面，其内装有光源，便于观察。

2．操作方法

在玻板上方格内加被检鸡血清一滴和抗原一滴，用牙签或塑料管头将抗原与血清充分混合。

3．结果判定

观察30～60秒钟，凝集者为阳性，否则为阴性，此试验应在10℃以上室温中进行。

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（三）卵黄平板凝集反应 1．主要材料

（1）抗原：同鸡白痢标准全血板凝集抗原。为观察明显，便于判定，可在100毫升抗原中加入1%的结晶紫溶液1毫升，置4℃冰箱中3～4天（每日摇动2～3次）。即成淡紫色抗原。

（2）待检鸡卵：预先编号，同种鸡号一致，或随机采集待检鸡群同一日内所产新鲜鸡卵。

2．操作方法：

先在蛋壳上打一约蚕豆大小的孔。放尽蛋清，用1毫升注射器插入卵黄中，吸取0.5毫升卵黄液于等量16%氯化钠溶液中，混匀后用滴管吸取一滴于玻板上，再加标准染色抗原一滴，与其充分混合，在22～25℃室温下观察反应。

3．结果判定

“＋＋＋＋”2分钟内出现大片的凝集，背景澄清 “＋＋＋”2分钟内出现较大的凝集

“＋＋”2分钟内凝集明显。但凝集颗粒较小 “＋”2分钟内出现微量的细小颗粒

“±”2－3分钟之后出现微量细小的凝集颗粒。 “－”滴加抗原后不出现凝集。

凡在两个“＋”以上者均判为白痢阳性。 （四）蛋黄（或血清）琼脂扩散试验 1．实验材料

（1）抗原：采用一般的鸡白痢诊断液，其中既有沉淀原，又含凝集原；也可将诊断液离心后取上清液作为可溶性抗原。其中含有沉淀原、无凝集原。

（2）鸡蛋：白痢病阳性鸡及阴性鸡所产的蛋。

（3）优质琼脂1.5克、NaCL5.0克，1%甲基橙0.02毫升，1%叠氮钠0.2毫升，蒸馏水加至100毫升。

（4）打孔器：口径为3和5毫米的金属小管。 （5）不锈金属丝环。 （6）消毒平皿。 2．操作方法

（1）将琼脂和氯化钠加入蒸馏水中煮沸后调PH至7.4。然后将叠氮钠和甲基橙加入，搅匀后倾倒于平皿内，每只平皿约25毫升，冷却凝固后即成琼脂板。

（2）视平皿大小，分成若干小区，每小区按纸样图案打孔。打一孔（直径5毫米），周围打6个孔（直径3毫米），孔间距4毫米。用大号针头挑出孔内的琼脂。孔打好后将琼脂板放在垫有石棉网的电炉上加热封底，使琼脂平皿底部略溶即可。

（3）加样：中心孔内加鸡白痢沉淀抗原，周围孔加蛋黄，标记各孔内的蛋号，加蛋黄时将蛋壳打破，倒去蛋白，用小铁丝环勾取蛋黄一滴加于孔内，以满为度。

（4）置琼脂平皿于37℃温箱中，24～48小时观察结果。 3．结果判定

将孵育后的琼脂平皿置光源下观察并记录沉淀线的有无与模式，凡帽黄与抗原之间出现细长、光滑、致密、清晰的白色沉淀线者判定为阳性反应，如相邻两孔样品均为阳性鸡血时，则在三个扩散圈交接处把两个沉淀线连接成稍弯曲，似倒V型的一条沉淀线，无沉淀者判为阴性反应。

4．注意事项

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（1）加样时以满为度，切不可外溢或夹有气泡。

（2）打孔时，按照事先制好的纸样图案，力求孔径、孔距、组距的准确。 （3）琼脂平皿封底时，温度掌握要适中，切不可过高。

全血平板凝集反应操作简便、快速、准确，适用于大群检疫。血清平板凝集反应和琼脂扩散沉淀反应在实验室内操作，不受外界气候条件影响，无非特异性反应，结果易于判定，可用于血检法中可疑反应鸡的复检，用卵黄代替全血或血清作鸡白痢检疫具有可在实验室内操作，不需逐个抓鸡耗费人力，惊动鸡群和结果易判定等优点，但由于种鸡开产期不整齐，要推迟检疫时间，另外尚需有单笼饲养或个体记录的条件，故仍不能代替全血平板凝集反应作为单一的、法定的检疫法，只能作为辅助的检疫法，例如作为种鸡群中鸡白痢病疫情的监测，血检中可疑反应鸡的判定，无白痢病种鸡群的每年定性抽检和进出口种蛋来源及品质的检验等等。除此之外，还有试管法和碘凝集法等。均可采用。

（五）碘凝集试验

本法只适合于血清凝集试验，而且属非特异性反应，但经多次实验，效果与血清平板法相近，比较可靠，同时碘试验来源广泛，易于保存，可代替鸡白痢多价抗原，在不易买到白痢抗原时利用该法尤为便利。

1．碘液配制：碘1.5克，碘化钾3克，蒸馏水50毫升，充分溶解，阴暗避光处保存。 2．操作判定：在洁净玻板上滴加待检血清2滴，碘液一滴，立即搅匀，2～3分钟判定。 3．结果判定：有明显的凝集片或大的凝集颗粒出现，而且不随玻板的摇晃而流动着判为阳性，否则为阴性。

十二、鸡枝原体的检疫

鸡霉形体病（MG、CRD）主要是由鸡败血霉形体引起的鸡和火鸡的慢性呼吸道传染病。其临床特征为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出罗音。在群饲养的仔鸡群（1～2月龄）中最容易发生流行，死亡率可达30%以上，而成年鸡多为散发及隐性感染，产蛋减少，造成严重经济损失。此病常通过患病鸡所产的蛋传给下一代。检疫本病是作平板反应。其中最好是用全血平板凝集反应方法，检出阳性鸡，淘汰处理，不作种用。现将此法介绍如下：

（一）试验材料

1．鸡霉形体全血平板凝集反应抗原，由生物药厂生产供应。本抗原是用国际标准“S6”株败血性鸡支原体菌经用牛心汤培养基制成的凝集反应平板染色抗原，应在2～15℃冷暗处保存，有效期为半年。

2．鸡霉形体病平板凝集反应阳性血清、阴性血清，由生物药厂生产供应。 3．器材：白瓷板（或玻璃板），采血用注射器，消毒针头以及搅拌细铁丝（或牙签）玻璃铅笔等。

（二）操作方法

1．全血平板凝集反应试验：在清洁的白瓷板（或玻璃板）上先滴两滴（约0.5毫升）染色抗原，然后以灭菌注射器及针头刺破被检鸡只翼下静脉吸血1滴（约0.03～0.05毫升），与抗原混合，用细铁丝充分搅拌，涂成直径1.5～2厘米左右的液面，稍静置后，轻轻摇动反应板，1～2分钟，即可判定结果。

2．血清平板凝集反应试验：先从被检鸡只翼下静脉微量采血分离出血清。取该血清滴在白瓷板（或玻璃板）上1滴，然后再滴加染色抗原1滴。与之混合，用细铁丝充分搅拌，涂成直径2厘米左右的液面，稍静置后，轻轻摇动反应板1～2分钟，即可判定结果。

（三）判定标准

1．抗原与血液搅拌后，在1～2分钟内呈现紫色絮状的大凝集块，短时间内血球可在液

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面中心部下沉者，为“＋＋＋＋”。

2．凝集块较小，凝集块在血滴边缘的血清层中清晰可见为“＋＋”。 3．菌体呈颗粒状凝集，多在边缘部分再现为“＋”。

4．液滴呈暗紫色混浊，菌体和血球逐渐下沉或仅在液面边缘部分出现颗粒状色带者，为“－”。

5．血清平板凝集反应判定标准，基本与全血平板凝集反应判定标准相同，但阴性反应时，在液滴中心呈絮状沉淀物，其它部分为均等紫色。

6．全血平板凝集反应或血清平板凝集反应，须在1～2分钟内呈“＋＋”以上反应者为阳性；2分钟以后出现凝集或2分钟内出现“＋”反应者，均为可疑。疑似反应，应在二周后重检一次。

（四）注意事项

1．抗原在使用前必须振荡，如在瓶壁附着有颗粒状物时（多在长期保存时出现）；必须强力振荡，使之均等悬浮后，方能使用。

2．每次检疫时，均须作阳、阴性血清对照。 3．反应须在15～25℃的温度下进行。 4．在做反应时所用器材应清洁无污。

十三、大肠杆菌病的实验室诊断

随着养鸡业的发展，大肠杆菌病的危害也越来越突出，已引起了人们的重视。本病的确诊主要靠实验室诊断，现将其方法介绍如下：

（一）镜检：取病死鸡肝、脾、心血等涂片，瑞氏或美兰染色，在显微镜（油镜头）下检查，可看到两端钝圆的短小球杆菌，从形态上很难与巴氏杆菌和沙门氏菌区分开。

（二）分离培养：大肠杆菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上即可良好生产。但为了与沙门氏菌或巴氏菌相区别，可用麦康盖或伊红－美兰鉴别培养基。本菌在麦康盖琼脂上培养24小时可形成中等大小的粉红色菌落，在伊红－美兰琼脂上形成黑红色菌落。在血液琼脂上有些菌株可产生溶血现象。在肉汤培养物中生长18～24小时呈均匀混浊，静置后有沉淀。

（三）生化试验：本菌能分解乳糖、葡萄糖和麦芽糖等，产酸产气，以此可与巴氏杆菌和沙门氏菌区分开。

（四）血清学试验：对分离的大肠杆菌可用多价血清和因子血清作玻板凝集反应进行血清型鉴定。引起鸡发病的大肠杆菌常见血清型有O1:K1·78:O80等。

（五）动物接种试验：动物接种的目的是检验所分离的大肠杆菌的致病性。常用的接种动物为小白鼠和雏鸡。将18～24小时的肉汤培养物0.1毫升静脉接种4周龄雏鸡，可引起死亡，不死亡者剖杀可见到大肠杆菌引起的某些病变，如气囊炎、心包炎等，某些菌株对小白鼠致病力较强，但也有一些菌株不一定引起小白鼠发病死亡。

十四、禽流感的实验室诊断

禽流感是我国近几年来新发生的重要传染病，对养鸡业危害极大。由于本病流行广，而且病原体血清型多、容易变异，感染本病的鸡群临床上可以表现多种多样的症状，有时很难与其它鸡病相区分，因此进行实验室诊断非常必要。按国家规定，本病只能由哈尔滨兽医研究所参考实验室进行诊断，主要包括病毒的分离和鉴定、血清学诊断，常用的血清学方法包括血凝抑制试验（HI）和琼扩试验（AGP）。

1．病毒的分离与鉴定 取发病严重或死亡鸡的气管、脾脏及输卵管、剪碎、研磨，用生理盐水作1:5稀释，rpm104离心30分钟，立即吸取上清加青链霉素（1000单位/毫升）于4℃作用1～2小时，绒毛尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2毫升。接种后37℃

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孵育，弃去接种后24小时内死胚，其余死胚随时取出放4℃冰箱。不死的胚于接种后72小时全部取出放4℃冻死。大多数胚在接种后60小时左右死亡。收取接种胚的绒毛尿囊液，并用0.5%的鸡红细胞测定尿囊液中病毒的血凝性。根据毒株不同，测得尿囊液的血凝（HA）价可由5log2到10log2不等。若无HA价，则可再盲传1～2代，仍无血凝价者，柯视为病毒分离阴性。对有血凝性的尿囊液，应再用已知流感阳性血清、新城疫阳性血清及减蛋综合征阳性血清分别作HI试验，能被流感阳性血清所抑制，而不被新城疫和减蛋综合征阳性血清所抑制者，即为禽流感病毒。有条件时还可用血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）因子血清作亚型鉴定。

2．HA试验

用品：灭活的流感病毒（鸡胚毒）、生理盐水、0.5%鸡红细胞、96孔V型滴定板，可调试微量加样器等。

红细胞的制备：按新城疫免疫监测（P40）一节中所述方法制备0.5%鸡红细胞。

操作方式：与41页新城疫病毒的HA试验操作及判定完全相同，只不过这里所测的病毒是流感病毒。

3．HI试验

除了已知对照血清为禽流感阳性血清，抗原为禽流感病毒8单位和4单位灭活抗原外，其他用品及操作与27页鸡新城疫β-微量法HI试验完全相同。也可用卵黄代替血清测定鸡群的HI抗体，方法同30页鸡新疫的卵黄HI试验。

4．AGP试验

用PH6.4的PBS（0.1mol/L）制成0.8%的琼脂板，并含有8%的氯化钠，然后按常规方法操作进行AGP试验（P47-48）

十五、炭疽的诊断和防治

目的

掌握炭疽实验室诊断的步骤和方法、熟悉炭疽的治疗要点、学会炭疽的预防接种技术。 内容及方法

（一）炭疽病畜的生前检查

流行病学：应了解病畜所在地区以往有无炭疽的发生、流行形式、发病季节、动物种类、发病和死亡情况、采取哪些相应的措施、对尸体如何处理以及近年来炭疽预防接种工作进行等情况。

临诊检查：除精神、食欲、结膜、体温等一般检查外，应特别注意喉部、腹下等处有无肿胀、肿胀的性质，病畜有无疝痛症（应与真疝痛区别），粪便是否带血。 （二）炭疽的实验室诊断

1．检验材料的采取 疑为炭疽死亡的动物尸体，通常不作剖检，应先自末稍血管采血涂片镜检，作补步诊断。不进行剖检的尸体可作局部解剖采取小块脾脏，然后将切口用浸透了浓漂白粉液的棉花或纱或纱布堵塞，妥为包装后送检。

2．镜检 取病畜濒死时或刚死亡动物的血液作涂片标本，最好用瑞氏或姬姆萨染色法染色，牛羊炭疽常可见到数量很多的有荚膜炭疽杆菌，单个或成对存在，偶有短链，菌端成方开，荚膜呈深红紫色。猪炭疽要采取病变部淋巴结或渗出液涂片检查。

3．培养检查 无菌采取病畜濒死期或刚死动物的病理材料，直接接种于普通琼脂平板及肉汤中，置37℃培养18～24小时，检查有无炭疽杆菌生长。如果检查材料已经陈旧或污染时，可将血液或组织乳剂先放到肉汤中加温65～70℃经10分钟，杀死无芽孢的细菌，然后吸取0.5毫升，接种于普通琼脂平板进行分离培养。

检查生长的菌落，如有疑似炭疽的菌落，则应取得纯培养。为了鉴定分离的细菌为炭疽

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杆菌，必须接种各种培养基，观察菌体的形态，菌落的形态及生化反应，同时接种实验动物观察菌体的致病能力。炭疽杆菌雨伪炭疽杆菌有某些类似之处，可参照表7予以鉴别。

表7 炭疽杆菌与伪炭疽杆菌的鉴别要点 鉴 别 方 法

运动力测定

高浓度CO2下培养于血清培养基上生长物 普通琼脂培养基上生长物 普通肉汤培养物 明胶穿刺培养 羊血琼脂平板培养 发酵杨苷 美兰还原试验 卵磷脂酶

对实验动物致病能力

炭疽菌

无 有荚膜 常成长链

不浑浊，无菌膜

倒立松树样生长，液化缓慢 溶血弱或不溶血 发酵缓慢或不发酵 还原缓慢 产生量小 有致病力

伪炭疽菌

一般有运动 无荚膜 常成短链

常浑浊，有菌膜

无倒立松树样生长，液化常快速 溶血明显 快速发酵 还原快速

蜡样杆菌常呈强阳性，大量产生 大多数没有致病力

上述的试验中，以运动力测定、荚膜形成、致病力，以及卵磷脂酶试验较为重要。 4．串珠试验 炭疽杆菌在适当浓度青霉素溶液作用下，菌体肿大形成串珠，这种反应为炭疽杆菌所特有，因此可用此法与其他需氧芽孢杆菌相鉴别。取培养4～12小时的肉汤培养物3管，其中两管各及时加入每毫升含5单位和10单位青霉素溶液0.5毫升（最终浓度含0.5和1.0单位）混匀，另一管加生理盐水0.5毫升，作为对照。置37℃孵育1～4小时（时间过久，串珠继续肿胀，容易破裂），取出加入20％溶液0.5毫升，固定10分钟后，涂片显微镜检查，找到典型串珠者可判为炭疽杆菌。

5． Ascoli试验 这是一种热沉淀反应，已被用于检查可疑尸体的感染兽皮、器官和组织中炭疽杆菌（炭疽免疫血清能与炭疽芽孢的抗原浸出物形成一种沉淀物）。这种试验是有一定特异性，仍在许多国家应用。操作方法，采集1g左右可疑病畜的组织，经研磨碎后，用5～10毫升含10％醋酸的碳酸生理盐水稀释，煮沸5分钟，冷却后过滤即成抗原。然后取一只小试管，加入0.5毫升抗炭疽血清，再小心将抗原滤液置于其上，如在15分钟内，在抗原和血清接触面形成一种环状混浊的沉淀环，则表示阳性反应。本实验应设正常血清和正常组织作对照。

6．炭疽杆菌荚膜荧光抗体染色：

（1）抗炭疽杆菌沉淀素荧光抗体的制备： 取生物制品厂所生产的炭疽沉淀血清，或用炭疽杆菌免疫家兔制得抗血清，用硫酸铵沉淀法提纯所得球蛋白与异硫氰酸荧光素标记。

（2）以病死畜的血液或脾脏涂片，固定后滴加标记过的抗体，满盖玻片，置室温或37℃染色30分钟，倾去荧光抗体液，采用PH8的PBS浸洗10分钟（中间换液一次），最后用蒸馏水轻轻冲洗2次，晾干。

（3）在荧光显微镜下检查，找到菌体周围有发光的荚膜，菌体较暗或不被染色，可判为阳性。如发现不带荚膜而发均匀荧光的杆菌，则不能判定为炭疽杆菌。

（三）炭疽的预防接种和治疗

1．炭疽的预防接种 在疫区对易感染家畜每年应进行炭疽芽孢苗预防注射。炭疽芽孢苗有两种：

（1）无毒炭疽芽孢苗 一岁以上的马、牛皮下注射1毫升，一岁以下的马和牛及猪和绵羊皮下注射0.5毫升。但不适于山羊的预防注射。

（2）二号炭疽芽孢苗 马、牛、羊和猪皮下注射1毫升。 注射后一周产生免疫力，免疫期为一年。

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2．紧急预防接种 适用于发生炭疽的核心地区或发生炭疽后，对健康家畜或有被感染危险的健康家畜进行紧急预防接种。可采用抗炭疽血清和无毒炭疽芽孢苗或二号炭疽芽孢苗同时注射，使被注射家畜先产生被动免疫，继而产生自动免疫。注射方法是在一侧颈部皮下注射10～20毫升的抗炭疽血清，另一侧颈部皮下注射炭疽芽孢苗。此种紧急预防接种的免疫期为半年。另一种用抗炭疽血清进行紧急预防注射，使被注射的家畜迅速获得被动免疫。大家畜皮下注射30～40毫升，猪羊为15～20毫升。如疑有潜伏感染时，大家畜皮下注射或静脉注射100～250毫升，猪羊为50～120毫升。此种紧急预防注射免疫期为10～14天。 3．炭疽的治疗：

（1）血清疗法：马牛一次用量为100～300毫升，猪羊30～80毫升。用血清治疗炭疽痈时，可行局部分点注射。

（2）抗生素、磺胺类药疗法 青霉素马牛按每公斤体重2000～4000单位；链霉素马每次2克，每日肌肉注射2次。磺胺嘧啶每公斤体重0.2克，每4h内服一次。

十六、巴氏杆菌的实验室诊断

目 的

初步掌握巴氏杆菌病的微生物学诊断步骤和方法。

内容和方法

1．检查材料 大家畜取新鲜的实质器官（肝、脾、肾、患病的肺脏等）、管状骨、心血（焊封于毛细管内），另做心血和实质器官的涂片数张；小动物或家禽可取完整的尸体。

2、镜检： 将病料涂片染色（美兰染色、革兰氏染色、瑞氏染色、姬姆萨染色等）镜检时，多杀性巴氏杆菌呈卵圆形，有明显的两极性染色，并可看到两极之间两侧的连线。血片用瑞氏或姬姆萨染色时，两极性菌呈蓝色或淡青色，红细胞染成淡红色（家禽红细胞含有紫色的核）。

3．培养 将病料分别接种于鲜血琼脂血清琼脂和普通肉汤，在37℃进行培养。多杀性巴氏杆菌在鲜血琼脂上呈较平坦、半透明的露滴样菌落，不溶血；在血清琼脂上生长丰盛，于45℃折射光线下检查可见有不同色泽的荧光，如Fg型的菌落呈现蓝绿色而带金光，边缘有狭窄的黄红光带，Fo型的菌落较大，呈现桔红带金光，边缘或有乳白色光带；在普通肉汤培养基中呈均匀混浊，以后便有沉淀，振摇时沉淀物呈辫状升起。当分得纯培养后，可由培养物作涂片检查（多杀性巴氏杆菌在从培养基上所作的涂片中，大部分不表现两极染色性，而常呈球杆状或双球状），并根据其形态学、染色性（革兰氏染色）、荧光性、培养特性、发酵性状及胆汁试验进行鉴定。 本菌的主要生化特性如下表 运动力 － 靛基质试验 ＋ 胆汁试验 － 荧光性 呈蓝绿色或桔红色荧光 葡萄糖 甘露醇 A ＊蔗糖 A 卫茅醇 A 乳鼠李糖 糖 － － A ＊：发酵产酸

4．动物试验 将病料研磨成糊状，用灭菌生理盐水稀释成1:5～1:10乳剂，接种于实验动物皮下或肌肉内，剂量为0.2～0.5毫升。猪、牛、羊等家畜的病料可用小鼠或家兔；家禽的病料可用鸽、鸡或小鼠。

实验动物如于接种后18～24小时左右死亡，则采取心血及实质脏器作涂片检查，接种

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培养基进行分离培养。根据病原的形态、染色、培养、生化等特性加以鉴定。在采取材料作培养、镜检完毕后，尚须对实验动物尸体进行剖检作病理变化的观察。在接种局部可见到肌肉及皮下组织发生水肿和发炎灶；胸腔和心包有浆液性纤维素性渗出物；心外膜有多数出血点；淋巴结水肿并增大；肝脏瘀血（如用鸡接种，尚可见有密布之小点坏死灶）。

十七、结核病的检疫

目的

掌握牛结核菌素变态反应的诊断方法。 内容及方法

牛结核菌素变态反应诊断有三种方法，即皮内反应，点眼反应及皮下反应。我国现在主要采用前两种方法，而且前两法最好同时并用。1985年以来，我国逐渐推广改用提纯结核素来诊断检疫结核病。 （一）老结核菌素变态反应

1．工作准备 在实验前先做好下列准备工作： (1)老结核菌素(O.T)。

(2)所需的药品器械 卡尺、酒精、来苏儿、脱脂棉、纱布、注射器、针头、煮沸消毒锅、镊子、毛剪、消毒盘、鼻钳、点眼管、记录表、工作服、帽、口罩、线手套及胶靴等。 (3)将牛只编号，术部剪毛。 2．操作方法

(1)牛结核菌素皮内反应：

注射部位：在颈侧中部上1/3处剪毛（3个月内犊牛可在肩胛部）直径约10厘米，用卡尺测量术部皮皱厚度。

注射剂量：用结核菌素原液，3个月以内的小牛0.1毫升；3个月至1岁牛0.15毫升；12个月以上的牛0.2毫升，必须注射于皮内。

观察反应：皮内注射后，应分别在72、120小时进行两次观察，注意肩部有无热、痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量术部肿胀面积及皮皱厚度。

在第72小时观察后，对呈阴性及可疑反应的牛只，须在原注射部位，以同一剂量进行第二回注射。第二回注射后应于第48小时（即120小时）再观察一次。 判定：

①阳性反应 局部发热，有痛感，并呈现不明显的弥漫性水肿，质地如面团，肿胀面积在35mm×45mm以上，或上述反应较轻，而皱皮厚度在原测量基础上增加8毫米以上者，为阳性反应，其记录符号为（＋）。

②疑似反应 局部炎性水肿不明显，肿胀面积在35mm×45mm以下者，皮厚增加在5～8毫米间，为疑似反应，其记录符号为（±）

③阴性反应 局部无炎性水肿，或仅有无热坚实及界限明显的硬块，皮厚增加不超过5毫米者，为阴性反应，其记录符号为（－）。

(2)结核菌素点眼反应 牛结核菌素点眼，每次进行两回，

十八、布氏杆菌病的检疫

目的 初步掌握布氏杆菌病的细菌学、血清学诊断及变态反应等检疫方法 内容及方法

家畜布氏杆菌病的检疫，即通过流行病学调查、临诊检查、细菌学检查、血清学检查及

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变态反应等方法，检出畜群中的患畜。

实验诊断的材料可采取胎儿、胎衣、阴道分泌物、乳汁、血液、血清、动物尸体以及马的脓肿中脓汁等。 (一)细菌学检查

1．染色检查 病料以绒毛叶渗出液、胎儿的胃内容物及肺脏、阴道分泌物及脓肿中的脓汁，以及培养物等制成抹片，除用革兰氏染色法染色外，应用鉴别染色法进行显微镜检查。布氏杆菌为球杆菌，0.5～0.7um×0.6～1.5um，无鞭毛，不产生芽孢，不呈两极浓染，病料抹片呈密集菌丛，成对或单个排列，短链较少，革兰氏染色阴性。它虽然不是抗酸性染色细菌，但可以抵抗脱色用的弱酸，例如0.5％乙酸。这种特性结合布氏杆菌鉴别染色技术用于诊断有一定实际意义。下面将列出两种较常用方法。

(1)改良Ziehl-Neelsen氏法 适于作胎膜和流产胎儿内容物染色之用。流产数日内取阴道拭子制作抹片，也可用此法染色。 ①抹片晾干，在火焰上固定。

②用Ziehl-Neelsen氏石炭酸复红原液的1:10稀释液染10～15分钟（原液为碱性复红1克，溶于10毫升l无水乙醇中，加入5％石炭酸溶液90毫升）。 ③水洗后，用0.5％乙酸脱色15～30秒。

④充分水洗后，用1％的美兰复染20～60秒。 ⑤水洗、干燥、镜检。

布氏杆菌染成红色，背景为蓝色。在胎膜抹片中经常看到布氏杆菌在染成蓝色的组织细胞中集结成团。此法对诊断绵羊地方流行性流产，胎儿弯杆菌及其他传染病也有价值。用此法染色时，胎儿弯杆菌和衣原体也染成红色，但可以从形态上区别。 (2)改良Koster法

①抹片自然干燥，用火焰固定。

②用新配制 的番红（Safranin）和氢氧化钾混合液（番红饱和水溶液2份与1摩尔氢氧化钾5份混合）染1分钟.。

③水洗后，用0.1％硫酸脱色10秒（或在10～20秒内用0.1％硫酸处理两次）。 ④水洗后，用1％美兰复染（3秒） 布氏杆菌呈桔红色，背景为蓝色。

2．培养 布氏杆菌在普通培养基上虽可生长，但更适宜的是肝汤培养基，有些菌株需要有血清或吐温40（Tween 40）才能生长，所以血清葡萄糖琼脂或吐温葡萄糖琼脂被认为是较好的常规培养基。此外，有的以胰蛋白 （Tryptose）琼脂、胰蛋白酶消化大豆（Trypticase-Soy）琼脂及Albimi Brucella agar （ABA）为最常用的基础培养基。在这些常用培养基内每100毫升中加入放线酮（Cycloheximide）10毫克，杆肽菌（Bacitracin）2500单位，乙种多粘菌素（Polymyxin B）600单位及乙基紫最终浓度80万分之一。也可在常用培养基内加入结晶紫（最终浓度为20万分之一至70万分之一），或乙基紫80万分之一制成选择培养基。

未经污染的材料接种于血清琼脂或肝汤琼脂上进行培养。为了抑制杂菌生长，特别是有可能被污染的材料接种于选择培养基上。同时接种两份，一份置于含有10％二氧化碳的密封容器中，以利于初分离时，需要二氧化碳的布氏杆菌的生长。

3．动物试验 在实验动物中，豚鼠用于布氏杆菌的分离检查上最适宜。将布氏杆菌注射于豚鼠皮下或腹腔后，将发生慢性疾病，表现脾肿、肝脏与肾脏有炎性坏死小病灶。注射3～4周已能在脾脏和淋巴结中找到细菌。小鼠、家兔、大鼠也用作实验动物。 病料内含菌量少而能检出的可靠方法就是接种豚鼠。如果病料污染较轻，可接种于豚鼠腹腔内，如果病料系乳汁或组织，可作皮下或肌肉注射。接种乳汁时，取20毫升乳样离心，将其沉淀物和乳皮层混合，接种两只豚鼠，每只接种一半混合物。每种病料至少接种豚鼠两

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只，一只在接种后3周剖杀，另一只在6周剖杀。剖杀前须采血作凝集反应，滴度1:5以上者为阳性。剖检豚鼠时，须注意肉眼可见病灶，如淋巴结肿大，肝的坏死灶，脾肿大或发生结节，睾丸及附睾脓肿，四肢关节肿胀等。脾和接种部位的淋巴结以及其他有病灶的组织均应剪碎，接种于不含抑菌染料或抗生素的固体培养基上。最好用血清葡萄糖琼脂。若剖杀前的血清凝集反应为阳性，即使剖检时的培养为阴性，也可诊断为布氏杆菌病。 (二)血清学诊断

应用血清学方法检出血清中有抗体存在，则说明被检动物为布氏杆菌病患畜。动物感染布氏杆菌以后首先出现的是凝集抗体，再过一段时间才出现补体结合抗体，最后产生变态反应性。补体结合反应是一种高度特异性的，其阳性反应与感染的符合率，比血清凝集试验与感染的符合率高。此种方法用来鉴别注苗后和自然感染所引起的血清学反应很有价值，如4～8个月犊牛注射19号菌苗、和山羊注射Revl号菌苗，经过6个月后补体结合反应应为阴性，而血清凝集反应仍为阳性或可疑。

我国的家畜布氏杆菌病检疫应用的免疫生物学方法主要是凝集试验，补体结合实验及变态反应试验。

1．试管凝集反应 本试验按《家畜布氏杆菌病试管凝集反应技术操作规程及判定标准》进行

（1）材料准备：

抗原：由兽医生物药品厂生产供应。使用时用0.5％石炭酸生理盐水作1:20稀释，长霉或出现凝集块的抗原不能应用。

被检血清：必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和气味。 阳性血清和阴性血清：由兽医生物药品厂生产供应。

稀释液：0.5％石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸与氯化钠配制，经高压灭菌后备用。检疫羊用稀释液用0.5％石炭酸和10％氯化钠溶液。 （2）操作步骤：

被检血清稀释度：一般情况，牛、马和骆驼用1:50、1:100、1:200和1:400四个稀释度；猪、山羊、绵羊和狗用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度。大规模检疫时也可用两个稀释度，即牛、马和骆驼用1:50、1:100；猪、羊、狗用1:25和1:50。

稀释血清和加入抗原的方法：以羊、猪为例的是：每份被检血清用5支小试管（8～10毫升），第1管加入稀释液2.3毫升，第2管不加，第3、4管和第5管各加入0.5毫升，用1毫升吸管取被检血清0.2毫升，加入第1管中，混匀（一半吹吸3～4次）吸取混合液分别加入第2管和第3管各0.5毫升，将第3管混匀，吸0.5毫升加入第4管，第4管混匀吸取0.5毫升加入第5管，第5管混匀后弃去0.5毫升。如此稀释后从第2管起血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50、1:100。然后将1:20稀释的抗原由第2管起，每管加入0.5毫升，血清最后稀释度由第2管起依次为1:25、1:50、1:100和1:200。

试管凝集反应也可用简便方式进行，即以0.2毫升吸管将被检血清以0.08、0.04、0.02及0.01分别加入4支小试管内，然后每管加入1:40稀释的抗原1毫升，充分摇匀，这样4管血清的最后稀释度分别为1:25、1:50、1:100和1:200。

牛、马和骆驼的血清稀释度和加抗原的方法与前述者一致，不同的仅第1管加稀释液2.4毫升及被检血清0.1毫升。加抗原后从第2管到第5管血清稀释度依次为1:50、1:100、1:200 1:400。

每种试验须作三种对照，阴性血清对照的步骤与被检血清者相同。阳性血清对照须将血清稀释到其原有滴度，其他步骤同上。抗原对照即将当时使用的已稀释抗原加等量稀释液，按表11比例配制。

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表11 比浊管配制方法

管号 1 2 3 4 5

全部试验充分震荡后，置37～38℃温箱中，22～24小时后用比浊管对照检查记录结果。出现50％以上凝集的最高稀释度就是这份血清的凝集价，因此50％亮度的比浊管很重要。 （3）结果判定：牛、马和骆驼血清凝集价为1:100以上，猪、羊和狗1:50以上者，判为阳性。牛、马和骆驼血清凝集价为1:50，猪、羊和狗为1:25者判为可疑。可疑反应的家畜经3～4周重检，牛、羊重检时仍为可疑，判为阳性。猪和马重检时仍为可疑，但农场中未出现阳性反应及无临诊症状的家畜，判为阴性。

鉴于猪血清常有个别出现非特异性凝集反应，在试验时须结合流行病学判定结果。如果出现个别弱阳性（例如凝集价为1:100～1:200），但猪群中均无临诊症状（流产、关节炎、睾丸炎），可以考虑此种反应为非特异性，经3～4周可采血重检。 检疫后应将结果通知畜主，通知单样式如下

布氏杆菌试管凝集反应通知单 登记号码 通知号码 畜别 采血日期：年月日 收到日期：年月日 检验日期：年月日 畜号 血清凝集价 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 畜主姓名 住址 判定 抗原稀释液(ml) 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0

试验用稀释液（ml） 1.0 0.75 0.5 0.25 0.0

清亮度（%） 100 75 50 25 0

标记 ﹟ +++ ++ ＋ －

备注 检疫机关： 检验人： 年月日

2．平板凝集反应：这种试验反应按《家畜布氏杆菌病平板凝集反应技术操作规程及判定标准》进行。

（1）操作步骤 最好用平板凝聚试验箱。无此设备可用清洁玻璃板，划成4cm2方格。横排5格，纵排可以数列，每一排第一格写血清号码，用0.2毫升吸管将血清以0.08、0.04、0.02、0.01毫升分别依次加于每排4小方格内，吸管须稍顷斜并接触玻璃板，然后以抗原滴管垂直于每格血清上滴加1滴平板抗原（1滴等于0.03毫升，如为自制滴管，须事先测定准确），或用0.2毫升吸管每格加0.03毫升。用牙签或金属棒将血清抗原混合，均匀。一份血清用一根牙签，以0.01、0.02、0.04的顺序混合。混合完毕后将玻板均匀加温约30℃左右（无凝集反应箱可使用灯泡或酒精火焰），5～8分钟按下列标准记录反应结果： ＃：出现大凝集片或小粒状物，液体完全透明，即100%凝集。 +++：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集。 ++：有可见凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50%凝集。 ＋：仅仅可以看见颗粒，液体浑浊，即25%凝集。 －：液体均匀浑浊，无凝集现象。

平板凝集反应的血清量0.08、0.04、0.02和0.01毫升加入抗原后，其效价相当于试管凝集价

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的1:25、1:50、1:100和1:200。

每批次平板凝集试验须以阴、阳性血清作对照。

（2）结果判定 判定标准与试管凝集反应相同。结果通知单只在血清凝集价的格内分别换成0.08（1:25）、0.04（1:50）、0.02（1:100）和0.01（1:200）。 每批次平板凝集试验须以阴、阳性作对照。

3．虎红平板凝聚试验： 这种试验是快速玻片凝集反应。抗原是布氏杆菌加虎红制成。它可与试管凝集及补体结合反应效果相比，且在犊牛菌苗接种后不久，以此抗原作试验就呈阴性反应，对区别菌苗接种与动物感染有帮助。

（1）材料准备 目前在国内只有中国医学科学院微生物学研究所生产供应布氏杆菌虎红平板试验抗原，可按说明书使用。阴、阳性对照同于试管凝集反应的阴阳性血清。

（2）操作步骤 被检血清和布氏杆菌虎红平板凝集抗原各0.3毫升滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一根火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4～10分钟内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。

（3）结果判定 在阳性血清及阴性血清试验结果正常的对照下。被检血清出现任何程度的凝集反应均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。

4．全乳环状反应：这是用乳汁进行的凝集反应，命名为ABR（Abortus,Bang Ring）。环状反应应用于乳牛及乳山羊布氏杆菌病检疫，以监视无病畜群有无本病感染。也可用于个体动物的辅助诊断方法。可由畜群乳桶中取样，也可由个别动物乳头取样。按《乳牛布氏杆菌病全乳环状反应技术操作规程及判定标准》进行。 （1）材料准备

抗原：由兽医生物制品厂生产供应。全乳环状反应抗原有两种，一为苏木紫染色抗原，呈蓝色。另一种是四氮唑染色抗原，呈红色。

被检乳汁须为新鲜全脂乳。凡、变酸和冻结的不适于本试验用（夏季采集的乳汁应于当天内检验，如保存于2℃时，7天内仍可使用）。患乳房炎及其他乳房疾病的乳汁、初乳、脱脂乳及煮沸乳汁也不能作环状反应用。

（2）操作步骤 取新鲜全乳1毫升加入小试管中，加入抗原1滴（约0.05毫升）充分振荡混合。置37～38℃水浴中60分钟。小心取出试管，务使振荡，立即进行判定。 （3）判定标准 判定时不论哪种抗原，均按乳脂的颜色和乳柱的颜色进行判定。

强阳性反应（+++）乳柱上层的乳脂形成明显红色或蓝色的环带，乳柱呈白色，分界清楚。 阳性反应（++）：乳脂层的环带虽呈红色或蓝色，但不如“ ”显著，乳柱微带红色或蓝色。 弱阳性反应（+）：乳脂层环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深。 疑似反应（±）：乳脂层环带不甚明显，并与乳柱分界模糊，乳柱带有红色或蓝色。 阴性反应（－）：乳柱上层无任何变化，乳柱呈均匀浑浊的红色或蓝色。

5．补体结合反应：本实验按《家畜布氏杆菌病全乳环状反应技术操作规程及判定标准》进行。

（1）材料准备 溶血素、补体、绵羊红细胞（2.5％）来源于一般补反试验。抗原和阴、阳性血清，由兽医生物药品厂生产供应，按说明书使用。试验所用稀释液用生理盐水。

被检血清以及阴、阳性血清在试验时用生理盐水1：10稀释按下列畜别血清灭能温度灭能30分钟；羊、马血清58～59℃，驴、骡血清63～℃，牛、猪血清56～57℃，骆驼54℃。 溶血素及补体效价的滴定，与一般补反试验相同。溶血素使用两个工作量，补体使用1个工作量。布氏杆菌补反抗原滴定与鼻疽补反抗原滴定在术式上相同，而布氏杆菌补反抗原在实际应用的稀释度应比滴定的效价浓25％，例如滴定的效价为1:150，实际使用时应作1:112.5稀释，如滴定效价为1:100时，则作1:75稀释使用。 （2）被检血清的正式试验：

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正式试验的各种成分即所准备的灭能被检血清及对照阴阳性血清、生理盐水、稍浓于一个工作量抗原，一个工作量的补体，两个工作量的溶血素及2.5％的红细胞。每种成分加入量为0.5毫升，各反应成分的总量为2.5毫升。 每份被检血清设置两个管，其中一支不加抗原作为对照。每批被检血清试验的对照管共7支，阳性血清2支，其中一支不加抗原，阴性血清2支，其中一支不加抗原；抗原对照管一支不加血清；溶血素对照管一支，不加血清，抗原及补体，补体对照管一支，只加补体及红细胞。不足2.5毫升的对照管，均以生理盐水补足2.5毫升。 试验中的两次加温，均为37～38℃水浴20分钟。

各试验管加温完毕后，取出立即进行第一次判定。要求不加抗原的阳性血清对照管，阴性血清对照管及抗体对照管呈完全溶血反应。静置12小时后作第二次判定，第二次判定时要求溶血素对照管，补体对照管呈完全不溶血反应。此时即可对被检血清进行判定。被检血清不加抗原管应是完全溶血，而加抗原管的判定按表12记录结果。 标准比色管配制方法及反应判定标准 溶血程度% 溶血溶液 2.5%红细胞 生理盐水 判定符号 判定标准 0 0 0.5 2.0 10 0.25 0.45 1.8 20 0.5 0.4 1.6 30 0.75 0.35 1.4 +++ 40 1.0 0.3 1.2 +++ 50 60 70 80 90 100 2.5 0 － 阴性 1.25 1.5 1.75 2.0 2.5 1.0 ++ 0.8 0.6 ++ ++ 0.4 0.2 + + 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 ++++ ++++ +++ 阳 性 疑 似 6．变态反应试验 本试验是用不同类型的抗原进行布氏杆菌病诊断的方法之一。布氏杆菌水解素即变态反应试验的一种抗原，这种抗原专供绵延和山羊检查布氏杆菌病之用。按《羊布氏杆菌病变态反应技术操作规程及判定标准》进行。 （1）操作步骤 使用细针头，将水解素注射于绵羊或山羊的尾褶壁部或肘关节无毛处的皮内，注射剂量为0.2毫升。注射前应将注射部位用酒精棉消毒。如注射正确，在注射部形成绿豆大小的硬包。注射一只羊，针头应用酒精棉消毒，然后再注射另一只。

（2）结果判定 注射后20小时和48小时各观察反应一次（肉眼观察和触诊检查）。若两次观察反应结果不符时，以反应最强的一次作为判定的依据。判定标准为： 强阳性反应（+++）：注射部位有明显不同程度肿胀和发红（硬肿或水肿），不用触诊，一望而知。

阳性反应（++）：肿胀程度虽不如上述现象明显，但也容易看出。 弱阳性反应(+)：肿胀程度也不显著，有时需靠触诊始能发现。 疑似反应（±）：肿胀程度似不明显，通常须与另一侧皱褶相比较。 阴性反应（－）：注射部位无任何变化。

阳性牲畜，应立即转入阳性畜群进行隔离，可疑牲畜须于注射后30日进行第二次复检，如仍为疑似反应，则按阳性牲畜处理，如为阴性则视为健康。

十九、口蹄疫的实验室诊断

目的

初步掌握口蹄疫的反向间接红细胞凝集试验，补体结合实验，琼脂扩散试验等血清学诊断技术。 内容及方法

当根据临诊和流行病学诊断为口蹄疫后，应进一步确定病毒的型，因为疫苗及血清的正

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确使用有赖于定型。病毒型鉴定的方法有以下几种。 (一)口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验

本方法用于检测被检动物血清中是否含有口蹄疫病毒感染相关（VIA）抗体（口蹄疫多型抗体），以证实被检动物是否感染过口蹄疫病毒。本试验适用于易感动物的检疫、疫情监测和流行病学调查。 1．材料准备

(1)Tris－盐酸缓冲液 Tris 2.42g Nacl 3.8g NaN3 0.2g

无离子水加至100ml，用HCL调PH至7.6。 (2)器材 平皿（直径5.5厘米）、吸管、金属打孔器外茎4毫米、模板，在有机玻璃上按以下规格打孔，一个中心孔和6个外周孔，所有孔的直径为4毫米，中心孔边缘到外周孔的距离均为4毫米。

(3)VIA抗原 见使用说明书。

(4)标准阳性血清 用A或O型口蹄疫病毒高免兔血清。 (5)微量注射器或盐水接头若干及乳胶头。 (6)印相暗盒或台灯（供观察沉淀线用） 2．操作方法

(1)被检血清和阳性血清均以56℃灭能30分钟。

(2)琼脂糖平板的制备 取琼脂糖1g，Tris-盐酸缓冲液100ml，装入三角瓶中，于沸水中加热或高压，将琼脂糖彻底融化。然后吸取7毫升琼脂液加到平皿里，制成3毫米厚的琼脂板。待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，储藏在4℃冰箱中备用。

(3)打孔 将模板放在琼脂板上，用打孔器通过模板的孔在琼脂板上打孔，并挑出孔中的琼脂块。

(4)加样 按图9方式加样，即中心孔加VIA抗原，1和4孔加FMD阳性高免兔血清，2、3、5、6孔加被检血清。

(5)扩散 将加样的琼脂平板置于湿盒里于室温（20～22℃）任其自然扩散。

(6)观察 于24小时进行第一次观察，72小时作第二次观察，168小时作最后观察。观察时，可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须借助于强光源才能看清沉淀线。 3．结果判定 当1和4孔标准阳性血清与抗原中心孔之间形成沉淀线时，若被检血清与中心孔之间也出现沉淀线，并与阳性沉淀线末端相融合，即被检血清判为阳性。被检血清孔与中心孔之间虽不出现沉淀线，但阳性沉淀线的末端向内弯向被检血清孔，则被检血清判为弱阳性。如被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且阳性沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。如图9所示，2孔被检血清为阳性，5孔被检血清为弱阳性，3、6孔被检血清为阴性。

(二)反向间接红细胞凝集试验 1．病料处理

（1）用PH7.2，0.11mol/L 磷酸缓冲液（或生理盐水）洗2～3次，并用消毒滤纸吸去水分。 （2）称重，加少许玻璃砂研磨，制成1：3悬液，室温浸毒1小时或4℃冰箱中过夜。 （3）3000～4000r/min ，离心20分钟，收集上清液。 （4）58℃水浴箱灭能40min（或不灭能）。

（5）3000～4000r/min ，离心20分钟，收集上清液即为被检抗原，置4℃冰箱中备用。 2．被检抗原的稀释 试管架上摆上一排试管8只，自第1管开始由左至右用稀释液进行倍比

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稀释（即1：6、1：12、1：24……1：768），每管体积0.5毫升。 3．滴加抗原的稀释 取有机玻璃反应板，在第1至第4排每排的第8孔滴加第8管稀释抗原2滴，每排的第七孔滴加第7管稀释抗原2滴，依此类推至第1孔，每排的第9孔滴加稀释液2滴，作为阴性对照，每排的第10孔按顺序分别滴加A、O、C、Asia四种标准抗原（1：30稀释）各2滴，作为阳性对照（注意每型换滴管1只）。 4．滴加红细胞诊断液 用前将红细胞诊断液摇匀，于反应板第1至第4排孔分别滴加A、O、C、Asia型红细胞诊断液1滴。轻轻振摇反应板，使红细胞均匀分布。室温放置1.5～2小时后判定结果。 5．结果判定

（1）判定标准 按以下标准判定红细胞凝集程度： ++++——完全凝集 +++ ——75%凝集 ++ ——50%凝集 + ——25%凝集 － ——不凝集

（2）观察反应板上各排孔的凝集图形。假如只1排孔凝集，且阴性对照孔不凝集（阴性），阳性对照孔凝集（阳性），其余3排孔不凝集，则证明此种凝集是与A型红细胞诊断液同型病毒病毒所致的特异性凝集，被检抗原即判为A型，若第二排孔凝集，其余3排孔不凝集，则被检抗原判为O型。依此类推。

（3）致敏红细胞凝集（凝集图形为＋＋以上者）的抗原最高稀释度为其凝集效价。

（4）某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数（以2为底）滴度以上者即可判为阳性。

(三)、补体结合实验 1．反应要素

（1）溶血素 生药厂出品

（2）补体 新鲜健康公豚鼠血清或冻干补体。 （3）红细胞 2％公绵羊红细胞悬液

（4）血清 口蹄疫A、O、C、Asia型高免豚鼠血清。 （5）抗原 病畜水泡皮毒。

2．被检抗原制备（由已知血清鉴定未知病毒） 将发病牛、羊、猪的新鲜水泡皮病料洗净，称重，研磨，用生理盐水作成1:2～1:3的乳剂，在室温浸出1～2小时，或在4℃浸一昼夜，摇动，以3000r/min，离心10分钟。取上清液于58℃灭能40分钟，即成被检抗原。

3．溶血素滴定：溶血素的滴定按一般程序进行。使用溶血素的工作量喂试验滴定度的4倍。如果试验滴定度味1:4000，则使用工作量为1:1000（表16）

溶血素滴定表 溶血素稀释度 稀释溶血素量(ml) 1:20补体(ml ) 2%红细胞(ml) 结 果 判 定 1:100 1:1000 1:2000 1:4000 1:5000 1:6000 1:7000 1:8000 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 放水浴箱内37～38℃ 15分钟 － － － － + ++++ ++++ ++++ 以后溶血素的滴定每1～2个月进行一次即可。

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4．补体的滴定： 滴定补体用1：20（即5％）补体，7个剂量（表17）；于7支试管中分别加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35毫升，在每个试管中补加生理盐水至0.5毫升。然后每个试管加工作量的溶血素0.5毫升，和2％的红细胞悬液0.5毫升。于37～38℃的水浴箱中放15分钟，完全溶血的补体的最小量，即为补体的滴定度（在补体滴定表内为2％）。

补体滴定表 每剂量中含纯补体的百分数 1:20的补体 生理盐水的量 溶血素的工作量 2%的红细胞 生理盐水 结 果

补体的工作量是滴定度再加1％（习惯上叫两个单位）。如滴定度为0.2毫升，也就是在一个剂量内含2％的纯补体，则其工作量应该是3％。本补反试验，要用四个补体量。如果两个单位是3％，则其余3个量为：三个单位是3.5％，四个单位是4％，五个单位是4.5。故此条件下，补体的滴定度不能低于0.25毫升。否则5％的补体就不能用了。 5．鉴定试验和对照实验 以上准备实验就绪后，就可进行病毒鉴定试验。操作步骤见表18。 毒型鉴定试验表 血清型别 被检抗原 已知血清 补体单位 补体量 O 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 2 3 4 5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 A 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 2 3 4 5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 C 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 2 3 4 5 0.2 0.2 0.2 0.2 Asia 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 2 3 4 5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 在37～38℃水浴箱中放15分钟 ++++ ++++ +++ － － － － 37～38℃水浴箱中放20分钟 溶血素加红细胞 37～38℃水浴箱中放30分钟 结果 － － － － ++++ ++++ ++++ ++++ － － － － － － － － 注：血清一般作1:3～1:5稀释。

0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 做鉴定试验时，须作血清的抗补体对照及抗原溶血和抗补体对照。操作步骤见表19。 对照试验表 血 清 O A C Asia 0.2 — — — — — — — 0.2 — — — — — — — 0.2 — — — — — — — 0.2 — — — — — — — 0.2 — — — — — — — 0.2 0.2 2 2 2 2 2 3 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 37～38℃水浴箱中20分钟

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正常血清 被检抗原 补体单位 补体量 生理盐水 溶血素加红细胞 结果 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 37～38℃水浴箱中30分钟 － － － － － － ++++ 反应管完全溶血的记：“－”； 阻止25%溶血的记：“+”； 阻止50%溶血的记：“++”； 阻止75%溶血的记：“+++”； 完全不溶血的记：“++++”。

6．评定结果 全部反应时间结束后，可以立即评定结果，也可以6～12小时后再评定一次。 7．补体结合反应毒型鉴定用的口蹄疫材料的采集、保存和运送办法

（1）为了口蹄疫的毒型鉴定，应采集2～3头病畜的水泡皮，可由兽医师和现地防疫员于每次发生口蹄疫时采集，送到有关单位鉴定。

（2）牛的水泡皮应自舌的表面采取，猪的自鼻面采取，羊 的自上颌牙齿边采取。 （3）应采新鲜成熟、未破裂、无异味的水泡皮紧密组织。

（4）先用水将牛舌洗净，用消毒剪刀剪下水泡皮，置于盛有50％甘油生理盐水的瓶中，或盛有PH 7.6磷酸缓冲液的瓶内。保存溶液1000毫升加杞奴锁1克。每次采取的水泡皮材料，不能少于10克，而保存液与组织之比不应低于10:1.

（5）采取的病料应注明采取的地点、时间、动物种类及数量。 （6）将采取的材料密闭加印冷藏，并派专人送有关实验室鉴定。 (四)乳鼠中和实验 1．试验材料

（1）送检血清 在牛、猪、羊患口蹄疫后，不早于10天和不晚于60天采血分离血清（恢复血清）作为送检血清，将分离出的血清3～5分钟倾入消毒的青霉素瓶中，在冷藏的条件下送检。在送检血清的说明书上，应注明采血牲畜的种类、年龄、患病时期、采血日期和保存方法。

（2）试验动物 选用营养良好，并有母鼠喂奶的5～7日龄的小白鼠（每份被检血清用12只）。在注射时须用镊子夹着小鼠的背部皮肤提起，不要用手接触，以免吃奶小鼠体表因污染人体的气味而被母鼠吃掉。如果用手碰摸了吃奶小鼠，则于注射后在它的体表擦少许乙醚除去气味。为了避免喂奶母鼠吃掉注射后的小鼠，可在注射前取出母鼠置于另一容器中，再一一取出乳鼠注射，然后放回容器内，待全部注射完毕后再放回母鼠。

（3）标准O、A、C和Asia型鼠化毒 将这些病毒分别磨碎，用生理盐水稀释（约为1：100和1:1000），使用方法可根据瓶签上的规定。

2．试验方法 将受检血清用生理盐水稀释后，每1毫升血清加2毫升生理盐水，稀释后在每只乳鼠的颈部皮下注射0.2毫升。注射后经24小时将小鼠分为四组，每组三只，各组涂以不同颜色。第一组每只于颈部皮下注射标准O型鼠化毒0.2毫升，第二组注射A型鼠化毒，第三组注射C型鼠化毒，第四组注射Asia型鼠化毒。注射后放回原处与母鼠同养。 同时每组设对照乳鼠2只，不注射血清，只分别注射各型鼠毒（用量与试验组相同），以检查每一型鼠化毒的致病力。四组共用8只小鼠。对照组涂以与试验组相同的颜色，然后放回母鼠处，但需与试验组分别饲养。

注射后所有乳鼠的观察期为3～4天，根据试验组和对照组的乳鼠发病死亡情况，统计其结果，进行判定。

乳鼠的典型症状是：呼吸急迫，前后肢麻痹，然后延至全身，多在感染后18～30小时出现病状，最后死亡。

根据送检血清对某一标准毒型（O，A，C，Asia）病毒的保护作用，来决定送检地区所

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流行口蹄疫的病毒型。设被检血清能保护注射Asia型病毒的小鼠，但不能保护注射其他型（O，A，C）病毒的小鼠，即可判定送检的口蹄疫血清属于Asia，其余类推。 在送检过程中，应该注意防止散毒。试验结束后，应将病鼠及死鼠烧毁，鼠笼或缸用3％NaOH消毒，器械用煮沸法消毒。

本法可用以鉴定口蹄疫病毒的主型。 (五)交叉免疫法

1．用新鲜送检毒以缓冲液或生理盐水冲洗两次，用灭菌的滤纸将送检病毒的水分吸去，再称其重量，剪碎，在乳钵中加中性玻璃砂研磨成糊状，然后加缓冲液或生理盐水作成1:10悬液，在室温中放置40分钟（在此期间，应搅拌三次），吸取上清液于离心管中，以3000r/min，离心15分钟，将上清液倾入另一试管中备用。 2．去豚鼠2～4只，将上述病毒上清液用结核菌素注射器及24号针头给豚鼠后肢跖部注射，直六针斜六针，每针穿过后再抽回孔道一半之处将病毒注入，注入量以病毒刚出针孔为原则，另外在跖部皮下注射一针，并于跖面用针扎刺，使刺伤刚刚出血，涂以上述离心沉淀物。 接种的豚鼠如对野毒敏感，注射部经12小时，即开始出现红肿，以后再经12～60小时，将跖皮采下，继续向下传代，每代2～4只，以新鲜水泡作继代用。

3．当野毒适应于豚鼠引起第二期水泡以后，如补体结合反应确定为A型，则一次接种豚鼠14～16只，分为7～8组，每组2只，经两周后，设对照豚鼠2只，再将各种A亚型标准病毒作成1:100的稀释液在跖部穿3～4针，观察其结果。如A2组不发生水泡，则属A2。如交叉免疫与补体结合反应相符合，则更可确定为A2型。若所用亚型没有一型得到完全保护，则可能为新亚型。

如有两种亚型不发病，可能与所用豚鼠太少有关。此时，可将不发病组加至6只，作进一步试验。

用牛也可以作交叉免疫，即在非流行地区选取健康牛数头，用野毒感染使之发病，经三周后，用已知病毒攻击、观察发病情况，以确定其毒型。 本法是补体结合反应的良好补充，当用补体结合反应确定口蹄疫病毒的主型后，可用此法进一步确定其亚型。

(六)口蹄疫和猪水疱病的鉴别诊断方法

1．乳鼠接种试验 选用2日龄和7～9日龄乳鼠进行试验。将病猪水疱皮或水泡液用每毫升加有青、链霉素各1000单位的无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液作1:10稀释，于4～10℃冰箱中作用2～4小时（或37℃温箱作用1小时）；每组用4～8只乳鼠，分别于背部皮下各注射0.1毫升，观察7天。乳鼠如发病多在24～96小时死亡。

结果：如2日龄和7～9日龄乳鼠都发病死亡，即可认为是口蹄疫；如2日龄乳鼠发病死亡，而7～9日龄乳鼠仍健活，即可认为是猪水疱病。 2．血清保护试验

（1）用已知血清鉴定未知病毒 被检病毒液的制备：将送检病料洗净，称重、研磨，用生理盐水或磷酸盐缓冲液作1:5～1:10的悬浮液，在4℃浸出24小时，或在室温浸出1～2小时，振荡，以3000r/min，离心10分钟，其上清液即为被检的病毒液。

乳鼠血清注射 用五窝2～3日龄的乳鼠，每窝10只，以1只母鼠哺乳，分别注射已知的猪水疱病及口蹄疫A、O、C、Asia型五个血清。每窝注射7只，留3只不注射，作病毒对照。注射的猪水疱病血清不稀释，口蹄疫血清作1:3～1:5稀释。每只乳鼠皮下注射0.1毫升。

接种病毒液（攻毒） 注射血清后6～24小时，接种制备好的被检病毒浸出液。每窝注射过血清的7只乳鼠，给5只接种病毒，留2只作血清健康对照，3只未注射血清的乳鼠，也同时接种病毒，每只皮下注射0.1毫升。

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观察与判定 接种病毒后，每天观察2～3次，连续观察6～7天。如注射猪水疱病血清的乳鼠被保护，血清对照鼠均健活，病毒对照鼠及注射其他各型口蹄疫血清的乳鼠均发病死亡（主要症状：猪水疱病是全身发抖，四肢强直；口蹄疫是神经麻痹，四肢瘫痪），则被检病料为猪水疱病，而不是口蹄疫，则依此类推。

（2）用已知病毒鉴定未知血清 被检血清的处理：将被检血清每毫升加青、链霉素各1000单位，在室温处理1小时。

乳鼠注射被检血清 用五窝2～3日龄乳鼠。每窝10只，以一只母鼠哺乳，用处理好的被检血清注射乳鼠，每窝注射7只，留3只作病毒对照，每只乳鼠皮下注射0.1毫升。 攻已知的病毒 注射血清后6～12小时，用猪水疱病及口蹄疫A、O、C、Asia型五个已知病毒进行接种，每一病毒接种一窝乳鼠，每窝注射过血清的7只乳鼠中，分别给5只接种病

－－

毒，留2只作血清的3只乳鼠也同时接种病毒，接种的各个病毒液作102～103稀释（约10000LD50），每只乳鼠皮下注射0.1毫升。

观察与判定 攻毒后，观察6～7天，每天观察2～3次。如果攻水疱病病毒的乳鼠被保护，血清对照乳鼠均健活，而猪水疱病的病毒对照鼠及攻各型口蹄疫病毒的乳鼠均发病死亡，则被检血清为猪水疱病血清，而不是口蹄疫血清。如为某型口蹄疫，则依此类推。 (七)间接血凝微量实验 试剂器材： 口蹄疫抗原 口蹄疫阳性血清 口蹄疫阴性血清 待检血清 稀释液

九十六孔微型板 加样器 振荡器 操作方法

1．每孔加入稀释液25微升；

2．第一列第一孔加阳性血清25微升，并倍比稀释至同列的第八孔； 3．第二列第一孔加阴性血清25微升，并倍比稀释至同列的第八孔；

4．待检血清25微升以次加入第三、四列等，并倍比稀释到同列的第八孔； 5．每孔加入抗原25微升。

放在振荡器上振荡2分钟，1～2小时后观察结果。 结果判定与分析：

以阳性血清出现八孔的凝集，阴性血清出现八孔的不凝集为准 以抗原全部凝集的最大稀释度为抗体的滴度。

二十、兔瘟的实验室诊断

兔瘟也叫兔病毒性出血症，是1984年在我国发现的兔的一种急性病毒性传染病。该病传播快、发病率和死亡率极高，对养兔业危害极大。本病的实验室诊断方法很多。但比较简便、快速、适用的方法是血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验。

（一）平板快速血凝和血凝抑制试验

1．材料：发病死亡兔的肝、脾或肾脏，用生理盐水制成1:5的悬液，离心后取上清备用。3%的为O型红细胞悬液。兔瘟阳性血清。白瓷板或玻璃板，棉签。

2．操作方法：用红铅笔在白瓷板上划好4×4厘米的小方格。在一个方格内滴加1:5

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脾、肝悬液2滴，生理盐水1滴，3%人O型红细胞悬液一滴，立即搅匀。另一个方格除将生理盐水换成兔瘟阳性血清外，其它与第一个方格操作相同。加样完毕并搅匀后，轻轻晃动瓷板，2－5分钟判定结果。如果第一个格内出现明显的红细胞凝集现象，而第二格不出现，则可诊断为兔瘟。

（二）微量血凝和血凝抑制试验

1．材料：1:5待测肝悬液，1%人O型红细胞悬液，生理盐水，兔瘟阳性血清，96孔V型滴定板，微量稀释器，微型振荡器等。

2．实验操作：先在96孔V型滴定板上每孔加0.05毫升生理盐水，再吸取0.05毫升1:5稀释的待测肝悬液加入第一孔，充分混合吸出0.05毫升加入第二孔，于第二孔充分混匀后吸出0.05毫升加入第3孔，依次倍比稀释至第11孔，弃去0.05毫升。然后每孔均加0.05毫升%人O型红细胞悬液，在微型振荡器上震荡半分钟，37℃反应45分钟观察结果。以红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数作为该份病料的血凝价。此为病毒的定量测定。

另也一块滴定板，按上述方法将病毒倍比稀释后，每孔加入兔瘟阳性血清一滴，震荡后37℃反应10分钟，再每孔加1%人O型红细胞悬液0.05毫升，振荡后37℃反应45分钟，观察结果。若血凝价比未加阳性血清者低2个滴度以上，则可将病料判为兔瘟阳性。此为病毒的定性测定。

二十一、乳胶凝集试验检测猪细小病毒的试验

试剂器材： 猪细小病毒抗原 猪细小病毒阳性血清 猪细小病毒阴性血清 待检血清 稀释液 加样器 操作方法

（1）定性试验：取被测样品（血清、全血、乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分别滴于载玻片上。各加乳 胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5分钟内观察结果。

（2）定量试验：先将被测样品在微量反应板或小试管内作连续稀释，各取1滴依次加于玻片上，随后各加乳胶抗原一滴。并做阳性、阴性对照各1份，搅拌并摇动1～2分钟，3～5分钟内观察结果。

3．结果判定：若乳胶100%凝集，液体完全透明记为＋＋＋＋；75%凝集记为＋＋＋；50%凝集记为＋＋；25%凝集记为＋，没有凝集且液体完全不透明记为－。

以出现＋＋以上凝集者判为阳性凝集。

二十二、犬细小病毒的实验室诊断

本病较简便实用的诊断方法是HA试验和琼扩反应，其操作方法如下： HA试验

取患犬粪便2克加入4倍量PBS，摇匀后rpm3000离心20分钟，取上清备用。从猪耳静脉采抗凝血，用5倍量PBSrpm2000洗涤3次，配成0.5%浓度悬液。

操作在96孔V型滴定板上进行。先在每孔中加入0.05毫升PBS，再吸取0.05毫升粪便上清液加入第一孔，充分混匀后吸出0.05毫升加入第二孔，依次倍比稀释至第11孔，弃

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去0.05毫升。然后每孔加入0.05毫升0.5%猪红细胞悬液，震荡后37℃反应1～2小时（或4℃反应3小时），判定结果。以红细胞发生完全凝集的粪便稀释倍数作为被检病料的病毒凝集价。

本病的HI试验方法基本与新城疫HI相同，只是用猪红细胞代替鸡红细胞，反应温度为37℃1～2小时或4℃ 3小时。

二十三、微量间接血凝检测猪瘟病毒抗体

1．试剂物品：猪瘟病毒正向间接血凝抗原、猪瘟病毒阳性血清由中国农科院兰兽研所制备，含有0.3%兔血清的PBS（PH7.0），96孔V型微量滴定板，微量加样器等。

2．操作术式：每份待测血清用8个孔，每孔先加PBS25微升，取待测血清25微升加入第1孔，然后倍比稀释至第8孔，弃去25微升。每孔加间接血凝抗原25微升，振荡1～3分钟，室温（20℃）反应60～90分钟，判定结果。

3．判定标准：红细胞100%被凝集者记为“＋＋＋＋”，75%凝集者记为“＋＋＋”，50%凝集者记为“＋＋”，25%凝集者记为“＋”，无任何凝集者记为“－”。以发生50%凝集的血清最高稀释倍数作为该份被测血清（样品）的间接血凝价。待测血清1:16（第4孔，即4log2）以上仍为阳性者，则判为猪瘟抗体阳性。成年免疫猪抗体水平一般在1:128以上，且抗体水平一致。一月龄以内仔猪的母源抗体应在1:16以上。自然感染猪的抗体水平一般在1:16以上，但抗体水平高低不一致。

4．注意事项：抗原不能冻结，用前要摇匀，反应板应洁净，待测血清最好56℃灭活30分钟。

猪瘟兔体交互免疫试验

1．试验动物的选择：选择体重1.5千克以上大小的清洁健康的家兔4只，分为2组；试验前3天开始测兔子的体温，间隔8小时，体温应该正常。

2．病料的处理：采病猪的淋巴结和脾脏等病料称重、研磨，作成1:10～1:5的悬液，静置、离心取上清液，每毫升加青、链霉素各1000单位。处理后以每只兔子5毫升的剂量肌肉内接种试验兔。如用血液，血液内需加抗凝剂，不用稀释每头接种2毫升。对照组不接种。

3．继续测体温：每隔6小时测1次，连结天。

4．动物接种：7天后用猪瘟兔化弱毒作1:20～1:50的稀释液静脉注射试验兔和对照兔，每只1毫升，每6小时测体温1次，连结3天。

5．记录每只兔的体温变化，绘制体温曲线图表。根据试验组和对照组兔的热反应进行诊断。

（1）如试验组接种病料后无热反应，后来接种猪瘟兔化弱毒后也无热反应，而对照组兔接种猪瘟兔化弱毒发生定型热反应，则诊断为猪瘟。

（2）如试验组接种病料后有定型热反应，后来接种猪瘟兔化弱毒不发生热反应，而对照组接种猪瘟兔化弱毒后发生定型反应，则表明病料内含有猪瘟兔化弱毒。

（3）如试验组接种病料后无热反应，后来接种猪瘟兔化弱毒后发生定型热反应，或接种病料后发生热后应，后来对接种猪瘟兔化弱毒又发生定型热反应，而对照组接种猪瘟兔化弱毒后发生定型热反应，则不是猪瘟。

二十四、乳胶凝集试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体

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1．物品试剂：PRRS病毒致敏乳胶抗原；PRRS阳性血清、阴性血清；稀释液；九十六孔V型板；载玻片；微量移液器；待测样品。

2．操作术式：

（1）定性试验：取被测样品（血清、全血、乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分别滴于载玻片上。各加乳 胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5 分钟内观察结果。

（2）定量试验：先将被测样品在微量反应板或小试管内作连续稀释，各取1滴依次加于玻片上，随后各加乳胶抗原一滴。并做阳性、阴性对照各1份，搅拌并摇动1～2分钟，3～5分钟内观察结果。

3．结果判定：若乳胶100%凝集，液体完全透明记为＋＋＋＋；75%凝集记为＋＋＋；50%凝集记为＋＋；25%凝集记为＋，没有凝集且液体完全不透明记为－。

以出现＋＋以上凝集者判为阳性凝集。

二十五、乳胶凝集试验测猪伪狂犬病毒抗体

1．物品试剂：PRV病毒致敏乳胶抗原；PRV阳性血清、阴性血清；稀释液；九十六孔V型板；载玻片；微量移液器；待测样品。

2．操作术式：

（1）定性试验：取被测样品（血清、全血、乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分别滴于载玻片上。各加乳 胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5分钟内观察结果。

（2）定量试验：先将被测样品在微量反应板或小试管内作连续稀释，各取1滴依次加于玻片上，随后各加乳胶抗原一滴。并做阳性、阴性对照各1份，搅拌并摇动1～2分钟，3～5分钟内观察结果。

3．结果判定：若乳胶100%凝集，液体完全透明记为＋＋＋＋；75%凝集记为＋＋＋；50%凝集记为＋＋；25%凝集记为＋，没有凝集且液体完全不透明记为－。

以出现＋＋以上凝集者判为阳性凝集。

动物接种：（只用于PRV的检查）

1．动物的选择：可选取家兔、大鼠等实验动物，多用家兔。

2．病料的处理：取脑和脊髓，称重、研磨、稀释、加双抗、静置或离心，取上清液用于动物接种。

3．动物接种：皮下、肌肉或脑内接种。

4．症状：家兔接种后约36～48小时兔子出现精神狂暴、惊恐、呼吸促迫，在接种部发生典型的奇痒症状；这种症状仅维持几个小时最后角弓反张，抽搐死亡，一般常于夜间死亡，在死兔口中有咬下的接种部位的被毛等。

二十六、乳胶凝集试验测猪萎缩性鼻炎病毒抗体

1．物品试剂：猪萎缩性鼻炎病毒致敏乳胶抗原；猪萎缩性鼻炎阳性血清、阴性血清；稀释液；九十六孔V型板；载玻片；微量移液器；待测样品。

2．操作术式：

（1）定性试验：取被测样品（血清、全血、乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一

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滴，分别滴于载玻片上。各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5 分钟内观察结果。

（2）定量试验：先将被测样品在微量反应板或小试管内作连续稀释，各取1滴依次加于玻片上，随后各加乳胶抗原一滴。并做阳性、阴性对照各1份，搅拌并摇动1～2分钟，3～5分钟内观察结果。

3．结果判定：若乳胶100%凝集，液体完全透明记为＋＋＋＋；75%凝集记为＋＋＋；50%凝集记为＋＋；25%凝集记为＋，没有凝集且液体完全不透明记为－。

以出现＋＋以上凝集者判为阳性凝集。

二十七、猪圆环病毒抗体ELISA检测

猪圆环病毒抗体的ELISA试剂盒及其方法,属于生物技术领域。方法经特异性、敏感性、重复性等指标的检验后，将其用于血清样品的检测。其优势体现在具有良好的特异性、可大量生产以及检测成本低廉。与美国IDEXX公司ELISA试剂盒的检测符合率为96%（美洲型检测符合率100%）。大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。

试剂盒组成 ELISA板条，20×洗涤液（W），20×血清稀释液（D），酶标二抗反应液（E），显色液（A），双氧水（H2O2），2 mol/L硫酸终止液（S），PRRSV标准阳性血清（P），PRRSV标准阴性血清（N）。

使用步骤

1. 用蒸馏水依次将W液和D液稀释好后备用

2. 用D液将待检血清1：40稀释后依次加入96孔ELISA板条1~93孔，每孔

100L

3. 在最后3孔依次加入P、N和D各100L 4. 37℃孵育1小时

5. 洗板：每孔加入300L W液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸

水纸上拍干

6. ELISA板上1~95孔各加入E液100L，第96孔加D液100L 7. 37℃孵育1小时

8. 洗板：每孔加入300L W液，静置5分钟后弃去。再重复3次后板条在吸

水纸上拍干

9. 将45L H2O2加入A液混匀后依次加入板条各孔100L，室温避光反应15~30

分钟

10. 每孔加入S液100L终止

用酶标仪在490nm测定OD值：检测样品OD490/已知阴性血清OD490＞2.1且已知阳性血清OD490＞1.0,即可判为阳性。

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第三部分 疫苗制造技术

一、鸡新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造

1．毒种：鸡新城疫Ⅰ系苗毒种，由中国农业部兽医药品监察所供给。 作为Ⅰ系苗毒种的条件是：

(1)对鸡胚的最小致死量不低于10-61毫升，鸡胚于接种后24～72小时内死亡，胚体病变明显，对红血球凝集在1:80以上；

(2)毒种对鸡的最小免疫量应不低于10-6 1毫升； (3)安全、无菌。

2．Ⅰ系苗(湿苗)的制造方法

(1)将健康的种鸡所产新鲜卵(一般不应超过7天)，除去卵壳外污物后，放入38.5～39℃，相对湿度在60～70%孵卵箱内孵化9～10日，作为制苗鸡胚的来源，鸡胚接种前，应照蛋挑选生活力强的发育胚，并划好气室部位和接种部位，凡生活力弱与死胚均不要。

(2)毒种移种时用无菌生理盐水将毒种作1:100稀释，接种9～10日龄鸡胚的尿囊腔内，每胚0.1毫升，接种以后融化石腊将卵壳上的接种孔封闭，继续置孵卵箱内孵化。此后，每日上下午各照蛋一次。胚胎应于接种后24～48小时内死亡(一般36小时前后死亡)，将死胚卵气室向上，置0～10℃冷却4～24小时，凡在24小时内和48小时以后死亡的胚卵均弃去不用。

(3)将冷却后的死胚卵取出，气室部向上并涂擦5%碘酊。用灭菌镊子敲破气室部位的卵壳并剔除之，揭去卵壳膜，剪破绒膜和羊膜，以无菌吸管吸取尿囊液和羊水，装入灭菌瓶内，若干胚的胚液混合为一组，并立即加入青霉素、链霉素各500单位、毫升。放入冰箱保存，经检验后即成疫苗。

在收获疫苗时，应观察胚体病变情况是否良好(胚体全身充血，在头、胸、背、翅和趾部有小出血点)。注意胚液是否清朗，若胚体无病变，胎儿，胚液混浊者应废弃，亦可同时收获胚体，和胚液一起磨碎，制成全胚疫苗。

(4)收获的鸡胚液应逐瓶进行无菌检验，即每瓶抽疫苗0.2毫升，分别接种于鲜血斜面和熟肉基内。在37℃培养72小时，应无细菌生长，然后将无菌生长之疫苗混合后，分装小瓶或安瓿内。每瓶(安瓶)0.5～1毫升。瓶上或安瓿上要注明疫苗名称、批号及收获日期。

以上各项操作均要在无菌室或无菌罩内以无菌手续进行之。要严防将鸡新城疫强毒污染其中。

3．疫苗检验：每批疫苗制好后，在使用前须做以下三项检验，均合格者方可使用。 (1)无菌检验：每批疫苗任抽5瓶作为样品，方法同上，应无细菌生长，在做细菌培养同时，亦可注射小白鼠若干只，每只皮下注射0.2毫升，观察10天，应全部不死。若有细菌生长或小白鼠死亡者，此苗废弃。

(2)安全试验：用4～12个月龄未经鸡新城疫疫苗免疫过的健康鸡3只，每只鸡肌注100倍稀释疫苗1毫升，观察10～14天，应无任何反应，或有轻度反应。且在14日内恢复者，认为合格，有重反应不能复原时，应予重复检验一次。

(3)效力试验

①选取4～12月龄的健康鸡若干只，分为二组，一组为对照组，所有鸡必须没有感染过鸡新城疫或没有接种过本病疫苗。如情况不明，应于试验前，每只鸡翅静脉抽血分离血清作血凝抑制试验，血凝抑制价在1:20以下者才能供试验用，超过1:20者不能用来试验。

②试验组每只鸡以1000倍稀释的疫苗肌注1毫升。观察10～14天后，与对照组一起以

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鸡新城疫强毒攻击。攻击量为每只鸡肌注1000倍稀释的新鲜鸡胚强毒液1毫升。观察10～14天，试验组免疫鸡应全部健活，而对照全部发病，并且至少死亡2/3方能合格，如果对照鸡不能全部发病或全部发病而死亡少于2/3时，可重复试验一次，如免疫鸡发病或死亡时，这批疫苗视为无效，予以废弃。

4．疫苗使用与保存 (1)使用方法

①本苗专供2个月以上的鸡使用，初生雏鸡禁用。

②使用时，用灭菌生理盐水或蒸馏水或冷开水(不可用热水或温水)将本苗稀释100倍，以消毒的钢笔尖蘸取稀释苗，刺入鸡翅膀内侧无血管处皮下(蘸、刺各两次)。或皮下注射0.1毫升，也可稀释1000倍，肌注1毫升。

③稀释后疫苗须冷藏，并于当日用完，次日无效。

④疫苗注射后3～4天，即可产生免疫力。免疫期成年鸡为1年，2月龄鸡为半年。 (2)保存：自鸡胚液收获日期算起，-15℃不超过20天，15～25℃不超过14天；25～30℃不超过7天。

二、鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗制造

(一)毒种

1．制造鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗的毒种，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供给。 2．制苗用毒种属于弱毒力毒株，必须符合下列标准：

①毒种对鸡胚的毒力：以毒种10倍稀释，尿囊内接种10日龄鸡胚10个，每胚0.1毫升。鸡胚应于接种后24～120小时内死亡70%以上，胎儿应有明显病痕，红细胞凝集价在1:0以上。

②毒种对1月龄雏鸡滴鼻免疫量小免疫量，应不低于10-31滴。 ③毒种对10日龄鸡胚半数感染量(EID50)，应不低于10-7/0.1毫升。 ④毒种对初生雏鸡不致病。 ⑤毒种须无菌。

⑥毒种经过免疫血清中和后不引起鸡胚死亡，血凝反应应为阴性。

3．毒种的保存：合乎上述标准的毒种，保存在-15℃，以上湿毒应不超过1年半继代1次；冻干毒不超过六年继代1次。湿毒和冻干毒在0～4℃保存，均不应超过4个月继代1次。

4．毒种继代：将毒种用灭菌生理盐水稀释10-4～10-5，以0.1毫升接种于孵育10日龄的鸡胚尿囊内(继代鸡胚所用鸡蛋，应来自未感染过鸡新城疫，及未经过鸡新城疫预防注射的健康鸡群)，选接种后72～120小时内死亡的鸡胚(72小时以前及120小时以后死亡的弃去不用)，且病痕显著者，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)装于灭菌试管内。每管分别用血清琼脂斜面及厌气肉肝汤各1份，作无菌检验，培养96小时，须无菌。并做红细胞凝集试验。将无菌且对鸡红细胞凝集价在1:0以上，对鸡胚的EID50达10-7、0.1毫升的鸡胚液混合在一起，分别于安瓿中保存。注明收获日期、毒种代数等或将合乎要求的鸡胚液混合，加等量5%蔗糖脱脂奶冻干，并进行检验，达到毒种标准时，亦可做制苗毒种。

5．抽取分装后毒种5瓶，用血液琼脂斜面，改良沙氏培养基或不滴定PH普通琼脂斜面各2管，每管接种0.2毫升；另以50～100毫升普通肉汤及厌气肉肝汤各1瓶，分别接种0.5～1毫升或做无菌检验，如无细菌生长，即可用作毒种。

6．有关毒种的继代过程，检验结果及保存方法等，均须详细记录于专用的表册中。

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(二)湿苗的制造

1．鸡蛋的选择和孵化：制造疫苗用的鸡蛋，宜采用受精率较高，确为健康鸡群所产的新鲜鸡蛋。清除蛋壳外的污物，并用消毒药液擦试干净，然后置38.5～39℃孵卵箱内孵化，其相对湿度最好保持在60～70%。

2．毒种接种：以10-4～10-5稀释的毒种0.1毫升，接种于孵育10日龄发育良好的鸡胚尿囊内。接种后，将卵壳钻孔用蜡封闭，置37℃孵卵箱孵育，此后可不必翻卵。

3．鸡胚接种后72小时以前死亡者弃去不用。72小时后每4～8小时照蛋一次，将死亡的鸡胚随时取出，至96～120小时，不论死亡与否全部取出，气室部向上直立，置于0～10℃中冷却。

4．鸡胚液收获：鸡胚于0～10℃冷却4～24小时后取出，将气室部位用碘酒消毒，然后无菌剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(注意勿使卵黄破裂)，吸出鸡胚液，每若干胚的鸡胚液混合为一组。置于灭菌瓶中，每毫升鸡胚液加入青霉素500单位，链霉素500微克，放冰箱处理。

5．在收获鸡胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿及鸡胚液混浊者弃去不用。 6．经处理后，分组作无菌检验，应无菌生长。

7．将无菌生长的鸡胚液，混合均匀后分装于安瓿，安瓿上应注明疫苗名称、批号及装量。若干支安瓿装于包装盒内，并附使用说明。每盒疫苗应粘贴标签，注明制品名称及制苗弱毒株号、批准文件、批号、包装量、检验号码、用法、保存方法、制造日期及厂名等。

8．在生产过程中，应特别注意不要混入或污染鸡新城疫疫强毒及其他鸡新城疫弱毒。 9．制造疫苗的所有过程，均须详细记录于专用表册中。 (三)疫苗的检验

1．无菌检验：每批疫苗(湿苗或干苗)，任抽5～15瓶组成5组。按《成品检验的有关规定》进行。

湿苗应无细菌生长。

冻干疫苗如有细菌生长时，应作杂菌计数和病原体鉴定。

杂菌的病原性鉴定：除按《成品检验的有关规定》进行外，并作鸡白痢等沙门氏菌的检验，应为阴性。其检验方法见附记事项。

杂菌计数：按《成品检验的有关规定》进行。每克组织(鸡胚液和胎儿混合疫苗每毫升鸡胚液按1克组织计数)的非病原菌应不超过1000个。

如果疫苗污染霉菌，应作为杂计菌数。如菌数不超过规定时亦可出厂。 2．安全检验：

①将疫苗按实含组织量10倍稀释，尿囊内接种10日龄鸡胚10个，每胚0.1毫升，接种后24～72小时内，鸡胚死亡率不超过20%为合格。若两次检验结果鸡胚均在接种后48小时内全部死亡，并确定是由于接种物引起，则该疫苗应判为不安全。不能用雏鸡再检，疫苗应予报废。

②用确无母源抗体2～7日龄雏鸡20只，分成两组，第一组10只，每只鼻孔内滴入5倍稀释疫苗两滴(约0.05毫升)，第二组10只，不接种疫苗，做为对照。两组在同样条件下分开饲养管理，观察10日，每组死亡的雏鸡，均须做详细的尸体剖检及细菌检验。最后结果，任何一组雏鸡不得有5只以上死亡。如两组雏鸡死亡数相等或第一组较第二组死亡数少时，疫苗判为合格。如第一组雏鸡死亡数较第二组多，但未超过二只，疫苗亦可判为合格。否则可重检1次。

3．效力检验

①用生后1～8个月的健康鸡8只，采血分离血清。做抑制红细胞凝集试验。证明确对新城疫不具免疫力。用5只鼻孔内滴入100倍稀释的疫苗2滴，10～14日后，与另3只对

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照鸡，同时肌肉注射强毒1毫升。强毒稀释倍数，对5个月以下鸡用1～5万倍；对5个月以上的鸡用1000倍。观察10～14日，如系用5个月以下的鸡，对照鸡应全部发病死亡；系用5个月以上的鸡，对照鸡应全部发病并最少死亡2只；免疫鸡须全部健活，疫苗判为合格。否则，可重检1次。

②用确知未经新城疫苗免疫鸡群所产蛋孵育的10日龄胚检验，将疫苗稀释成10～6、10～7、10～8三组，每组接种鸡胚5个，每胚0.1毫升，48小时前死亡的鸡胚不计，随时取出48～120小时死亡的鸡胚。收获胚液，同组等量混合，至120小时取出活胚逐个收获胚液，分别测定红细胞凝集价，1:160以上判为感染，计算半数感染量(EID50)，EID50≥10-7/0.1毫升，疫苗判为合格。否则可重检1次，或用鸡重检1次。

注：①对提供生产或检验用鸡或鸡蛋的鸡场，应确保无鸡新城疫；对鸡支原体、鸡白痢、鸡伤寒或鸡马立克氏病等传染病，应进行定期检疫。

②效力检验的鸡，应选自未感染过鸡新城疫的鸡群，且未经新城疫苗预防接种的健康鸡，其血清的抑制凝集价应为0。

③效检用强毒毒力标准：对鸡的最小致死量，须不低于10-61毫升(肌肉注射，14日内死于新城疫)；对鸡胚的最小致死量，须不低于10-60.1毫升(尿囊内注射，并须在接种后24～72小时内全部死亡，且胎儿病痕明显)。

④效力检验用的鸡胚来源与毒种继代用鸡胚相同。

4．物理性状检验：湿苗为淡白色或淡红色的澄清液体，在安瓿的底部，可能有少量的沉淀物，如发现液体混浊、变色或有其他异物及有异味者，均应废弃。

5．所有检验过程及检验结果，均须详细记录于专用的表册中。 6．成品留样：按《成品检验的有关规定》进行。 (四)疫苗的保存

湿苗的保存：自鸡胚液收获日期算起：

1．疫苗在-15℃下保存最长不超过1年，为保证出厂疫苗的使用效果，低温结冻保存的疫苗，在一年期限内的后3个月中，产品出厂前，必须按效检方法用鸡胚效检1次，合格的疫苗1个月内必须出厂。

2．在-15℃以下保存的疫苗，符合上述标准时，出厂后应用的有效保存期，可与下述3项相同。

3．在0～4℃保存，应不超过3个月；在10～15℃保存，应不超过20日；在16～25℃保存，应不超过14日；在26～30℃保存，应不超过7日。

冻干疫苗的保存：自鸡胚液收获日期算起： 1．在-15℃保存，最长不超过2年。

2．在0～4℃保存，最长不超过8个月；在10～15℃保存，最长不超过3个月；在25～30℃保存，最长不超过10日。

(五)疫苗的使用

1．本疫苗对于各种日龄的鸡均可使用，但一般用于7日龄以上的雏鸡较好。

2．滴鼻免疫时用生理盐水、蒸馏水或冷开水(严禁用热水或温水及加消毒剂的水，如城市自来水)，将疫苗稀释10倍，用滴管吸取疫苗，滴入鸡鼻孔内2滴(约0.05毫升)。饮水免疫时，用冷开水、井水(忌用含氯等消毒剂对疫苗有害物质的水)将疫苗稀释。其稀释剂量根据鸡龄大小而定，使用疫苗剂量不论鸡龄大小，平均每只鸡饮用实含病毒量0.01毫升( 克)。

3．疫苗加水稀释后，应放冷暗处，必须当天用完。

4．免疫后7～8天产生免疫力，免疫持续时间根据鸡体本身的免疫状态和日龄而不同。对鸡免疫状态监测是必要的。

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(六)附记事项

1．胎儿病痕：在接种后72小时后死亡的鸡胚，多为全身充血。72～120小时死亡的，除有全身充血外，在头、胸、背、翅及趾端出血点；在120小时以后死亡的，除有上述病痕外，或呈发育不全、卷曲成团、失水干硬等病变。

2．试验用鸡要求：用生后1～8个月的鸡，同批试验鸡的年龄、体重、营养状况等不得有显著差别。使用前采血，取血清作抑制红细胞凝集试验，确证其未感染过鸡新城疫，也未经预防注射的，其抑制凝集价为0，方可使用。

3．红细胞凝集试验：将毒种用生理盐水稀释成不同倍数，分别加于8支小圆底试管内，然后加入红细胞。红细胞采取健康鸡血液(每次可由心脏采血5～10毫升)，以生理盐水洗涤3～5次(用3000转/分钟，离心洗涤)，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉积的红细胞用生理盐水稀释成100倍悬浮液应用。加1%稀释的红细胞后，置于20～30℃，15分钟后检查结果，以红细胞凝集50%的稀释度作为判定终点。

试验操作术式如下表： 试管号 病毒稀释倍数 生理盐水 (毫升) 病毒(毫升) 1%红细胞 (毫升) 1 10 0.9 0.1 0.5 2 20 0.5 0.5 0.5 3 40 0.5 0.5 0.5 4 80 0.5 0.5 0.5 5 160 0.5 0.5 0.5 6 320 0.5 0.5 0.5 7 0 0.5 0.5 0.5 8 1280 0.5 0.5 弃去0.5 0.5 9 对照 0.5 － 0.5 4．抑制红细胞凝集试验：采取试验鸡的血液少许，分离血清，稀释成不同倍数，按下表量加入到数支试管内，然后加入经上项方法测定的已知凝集价的病毒稀释液。如该病毒经上项方法测凝集价为160倍时，则按其试管号数倒退二管的稀释倍数，即40倍稀释，充分振荡后，静置5～6分钟，再加入红细胞。以后检查及记录结果与上项3同。免疫鸡的血清，能抑制病毒与红细胞凝集作用，健康鸡血清则无作用。以红细胞凝集50%的稀释度，作为判定终点。

试验方法如下表 试管号 病毒稀释倍数 生理盐水 (毫升) 病毒(毫升) 1 5 0.4 0.1 0.25 0.5 2 10 0.25 0.25 3 20 0.25 0.25 4 40 0.25 0.25 5 80 0.25 0.25 6 160 0.25 0.25 7 320 0.25 0.25 8 0 0.25 0.25弃去0.25 9 0.25 － 0.25 0.5 10 0.5 － － 1280 对照 稀释之 病毒胞(毫升) 1%红细胞 (毫升) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

5．微量血凝试验：(1)在微量凝集试验板上，从第1孔至12孔或所需之倍数孔，用定量针头，每孔加入生理盐水1滴(每滴0.025毫升)，用稀释棒蘸取被检鸡胚液1滴，从第一孔起依次作倍数稀释，至最后一个倍数孔，弃去稀释棒内的1滴。

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(2)每孔加入1%鸡红细胞悬浮液1滴，并设不加病毒的红细胞对照孔，立即在微量振荡器上摇匀，置室温30分钟左右观察结果。

(3)红细胞凝集50%的稀释度，作为判定血凝价终点。 注：1%鸡红细胞制备及要求同试管法。 6．微量抑制血凝试验

(1)按5项的方法测定病毒的血凝价。

(2)在微量凝集试验板上，自第1孔至12孔或所需之倍数孔，用定量针头每孔加生理盐水1滴(每滴0.025毫升)。用稀释棒蘸取被检血清1滴，从第1孔开始，依次作倍量稀释至最后一个倍数孔，弃去稀释棒内的1滴。

(3)每孔用定量针头加入已稀释病毒1滴，放微量振荡器上摇匀，静置3～5分钟后，用定量针头每孔加1%鸡红细胞悬浮液1滴，并设病毒对照及红细胞对照孔，再放微量振荡器上摇匀，置室温30分钟左右观察结果。

(4)所用病毒量为4个单位的血凝价，如血凝价为1024，则病毒稀释度为1024/4=256(倍)。 (5)以红细胞凝集50%的稀释度，作为判定的终点。抑制血凝价4倍以内的为阴性；8倍为可疑；16倍以上为阳性。(但疫苗检验用鸡，抑制血凝价为0，方可使用)。

7．鸡白痢等沙门氏菌的检验

将被检物接种到普通肉汤和厌气肉肝汤培养基中，于37℃培养24～48小时，选其生长旺盛的好气、厌气培养液各1～2管(瓶)分别用1～2个S·S琼脂平皿划线，置37℃培养18～24小时，挑选无色、半透明、边缘整齐、光滑、稍呈隆起的小菌落与鸡白痢阳性血清作玻片凝集反应，在2分钟内出现凝集者即为阳性，如无可疑菌落，或菌落太小，不易辩认时，可继续培养24小时，挑选可疑菌落。如仍无可疑菌落，可不必做凝集试验，即可判为阴性。

附：S·S琼脂配方：

蛋白5克 牛肉膏5 克乳糖10克

琼脂25克 胆盐10克 0.5%中性红水溶液4.5毫升 枸椽酸钠10～14克 0.1%煌绿溶液0.3毫升 枸椽酸铁0.5克 蒸馏水1000毫升

8．以下两种免疫程序可供参考

(1)一般在蛋鸡10～14日龄时作第一次免疫(滴鼻、饮水和气雾均可)，同时新城疫油乳剂灭活疫苗0.25毫升皮下注射，2月龄时用新城疫Ⅰ系疫苗肌肉注射，4月龄时再用新城疫Ⅰ系疫苗和油乳剂灭活疫苗同时分开注射。这样可保证鸡群在整个产蛋期内不发生新城疫。

(2)2月龄以前与(1)相同，到开产前再用灭活苗注射一次，同时用Ⅰ系苗2倍量饮水。

三、鸡新城疫LaSota系弱毒疫苗制造

(一)毒种 1．制造鸡新城疫LaSota系弱毒疫苗的毒种，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供给。 2．制苗用毒种属于弱毒力毒株，必须符合下列标准：

①毒种对鸡胚的毒力为10倍稀释液尿囊内接种0.1毫升，鸡胚应于接种后24～120小时内死亡70%以上，胎儿应有明显病痕，红细胞凝集价在1:0以上。

②毒种对1月龄雏鸡滴鼻免疫量小免疫量，应不低于10-3滴。 ③毒种对10日龄鸡胚半数感染量(EID50)不低于10-7/0.1毫升。 ④毒种对初生雏鸡不致病。 ⑤毒种须无菌。

⑥毒种经过免疫血清中和后不引起鸡胚死亡，血凝反应应为阴性。

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3．毒种的保存：合乎上述标准的毒种，保存在-15℃，湿毒应不超过1年半继代1次；冻干毒不超过六年继代1次。湿毒和冻干毒在0～4℃保存均不应超过4个月继代1次。

4．毒种继代：将毒种用灭菌生理盐水稀释1～10万倍以0.1毫升接种于孵育10日龄的鸡胚尿囊内(继代鸡胚所用鸡蛋，应来自未感染过鸡新城疫，及未经过鸡新城疫预防注射的健康鸡群)，选接种后72～120小时内死亡的鸡胚(72小时以前及120小时以后死亡的弃去不用)，且病痕显著者，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)装于灭菌试管内。每管分别用血清琼脂斜面及厌气肉肝汤各1份，作无菌检验，培养96小时，须无菌。并做红细胞凝集试验。将无菌且对1%鸡红细胞凝集价在1:0以上，对鸡胚的EID50达10-7/0.1毫升的鸡胚液混合在一起，分装于安瓿中保存。注明收获日期、毒种代数等，或将合乎要求的鸡胚液混合，加等量5%蔗糖脱脂奶冻干，并进行检验，达到毒种标准时，亦可做制苗用毒种。

5．抽取分装后毒种5瓶，用血液琼脂斜面，改良沙氏培养基或不滴定PH普通琼脂斜面各2管，每管接种0.2毫升；另以50～100毫升普通肉汤及厌气肉肝汤各1瓶，分别接种0.5～1毫升或做无菌检验，如无细菌生长，即可用作毒种。

6．毒种的继代过程、检验结果及保存方法等，均须详细记录于专用的表册中。 (二)湿苗的制造

1．鸡蛋的选择和孵化：制造疫苗用的鸡蛋，宜采用受精率较高，确为健康鸡群所产的新鲜鸡蛋。清除蛋壳外的污物，并用消毒药液擦试干净，然后置38.5～39℃孵卵箱内孵化，其相对湿度最好保持在60～70%。

2．毒种接种：以10-4～10-5稀释的毒种0.1毫升，接种于孵育10日龄发育良好的鸡胚尿囊内。接种后，将卵壳钻孔用蜡封闭，置37℃孵卵箱孵育，此后可不必翻卵。

3．鸡胚接种后72小时以前死亡者弃去不用。72小时后每4～8小时照蛋一次，将死亡的鸡胚随时取出，至96～120小时，不论死亡与否全部取出，气室部向上直立，置于0～10℃中冷却。

4．鸡胚液收获：鸡胚于0～10℃冷却4～24小时后取出，将气室部位用碘酒消毒，然后无菌剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(注意勿使卵黄破裂)，吸出鸡胚液，每若干胚的鸡胚液混合为一组。置于灭菌瓶中，每毫升鸡胚液加入青霉素500单位，链霉素500微克，放冰箱处理。

5．在收获鸡胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿及鸡胚液混浊者弃去不用。 6．经处理后，分组作无菌检验，应无菌生长。

7．将无菌生长的鸡胚液，混合均匀后分装于安瓿，安瓿上应注明疫苗名称、批号及剂量。若干支安瓿装于包装盒内，并附使用说明书。每盒疫苗应粘贴标签，注明制品名称及制苗弱毒株号、批准文号、批号、包装量、检验号码、用法、保存方法、制造日期及厂名等。

8．在生产过程中，应特别注意不要混入鸡新城疫强毒及Ⅰ系毒。 9．制造疫苗的所有过程，均须详细记录于专用表册中。 (三)疫苗的检验

1．无菌检验：每批疫苗(湿苗或干苗)，任抽5～15瓶组成5组。按《成品检验的有关规定》进行。

湿苗应无细菌生长。

冻干疫苗如有细菌生长时，应作杂菌计数和病原性鉴定。

杂菌的病原性鉴定：除按《成品检验的有关规定》进行外，并作鸡白痢等沙门氏菌的检验，应为阴性。其检验方法见附记事项。

杂菌计数：按《成品检验的有关规定》进行。每克组织(鸡胚液和胎儿混合疫苗每毫升鸡胚液按1克组织计算)的非病原菌应不超过1000个。

如果疫苗污染霉菌，应作为杂计菌数。如菌数不超过规定时亦可出厂。

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2．安全检验：

①将疫苗按实含组织量10倍稀释，尿囊内接种10日龄鸡胚10个，每胚0.1毫升，接种后24～72小时内，鸡胚死亡率不超过20%为合格。若两次检验结果鸡胚均在接种后48小时内全部死亡，并确定是由于接种物引起，则该疫苗应判为不安全。不能用雏鸡再检，疫苗应予报废。

②用确无母源抗体2～7日龄雏鸡20只，分成两组，第一组10只，每只鼻孔内滴入5倍稀释疫苗两滴(约0.05毫升)，第二组10只，不接种疫苗，做为对照。两组在同样条件下分开饲养管理，观察10日，每组死亡的雏鸡，均须做详细的尸体剖检及细菌检验。最后结果，任何一组雏鸡不得有5只以上死亡。如两组雏鸡死亡数相等或第一组较第二组死亡数少时，疫苗判为合格。如第一组雏鸡死亡数较第二组多，但未超过二只，疫苗亦可判为合格。否则可重检1次。

3．效力检验

①用生后1～8个月的健康鸡8只，采血分离血清。做抑制红细胞凝集试验。证明确对新城疫不具免疫力。用5只鼻孔内滴入100倍稀释的疫苗1滴，10～14日后，与另3只对照鸡，同时肌肉注射强毒1毫升。强毒稀释倍数，对5个月以下鸡用1～5万倍；对5个月以上的鸡用1000倍。观察10～14日，如系用5个月以下的鸡，对照鸡应全部发病死亡；系用5个月以上的鸡，对照鸡应全部发病并最少死亡2只；免疫鸡须全部健活，疫苗判为合格。否则，可重检1次。

②用确知未经新城疫苗免疫鸡群所产蛋孵育的10日龄胚检验，将疫苗稀释成10-6、10-7、10-8三组，每组接种鸡胚5个，每胚0.1毫升，48小时前死亡的鸡胚不计，随时取出48～120小时死亡的鸡胚。收获胚液，同组等量混合，至120小时取出活胚逐个收获胚液，分别测定红细胞凝集价，1:160以上判为感染，计算半数感染量(EID50)，EID50≥10-7/0.1毫升，疫苗判为合格。否则可重检1次，或用鸡重检1次。

注：①对提供生产或检验用鸡或鸡蛋的鸡场，应确保无鸡新城疫；对鸡支原体、鸡白痢、鸡伤寒或鸡马立克氏病等传染病，应进行定期检疫。

②效力检验的鸡，应选自未感染过鸡新城疫的鸡群，且未经新城疫苗预防接种的健康鸡，其血清的抑制凝集价应为0。

③效检用强毒毒力标准：对鸡的最小致死量，须不低于10-61毫升(肌肉注射，14日内死于新城疫)；对鸡胚的最小致死量，须不低于10-60.1毫升(尿囊内注射，并须在接种后24～72小时内全部死亡，且胎儿病痕明显)。

④效力检验用的鸡胚来源与毒种继代用鸡胚相同。

4．物理性状检验：湿苗为淡白色或淡红色的澄清液体，在安瓿的底部，可能有少量的沉淀物，如发现液体混浊、变色或有其他异物及有异味者，均应废弃。

5．所有检验过程及检验结果，均须详细记录于专用的表册中。 (四)疫苗的保存及使用

1．湿苗的有效保存期：自鸡胚液收获日期算起：

(1)疫苗在-15℃下保存最长不超过1年，为保证出厂疫苗的使用效果，低温结冻保存的疫苗，在一年期限内的后3个月中，产品出厂前，必须按效检方法用鸡胚效检1次，合格的疫苗1个月内必须出厂。

(2)在-15℃以下保存的疫苗，符合上述标准时，出厂后应用的有效保存期，可与下述(3)项相同。

(3)在0～4℃保存，应不超过3个月；在10～15℃保存，应不超过20日；在16～25℃保存，应不超过14日；在26～30℃保存，应不超过7日。

2．冻干疫苗的有效保存期：自鸡胚液收获日期算起：

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(1)在-15℃保存，最长不超过2年。

(2)在0～4℃保存，最长不超过8个月；在10～15℃保存，最长不超过3个月；在25～30℃保存，最长不超过10日。

3．本疫苗供预防鸡新城疫病使用，对初生雏鸡滴鼻时有激发支原体病的可能，有时会引起轻微的呼吸道症状，一般用于7日龄以上雏鸡较好。考虑鸡群可能潜伏支原体病，因此，如用本疫苗进行气雾方法免疫，鸡龄应有一个月以上。

4．滴鼻免疫时用生理盐水、蒸馏水或冷开水(严禁用热水或温水及加消毒剂的水，如城市自来水)，将疫苗稀释10倍，用滴管吸取疫苗，滴入鸡鼻孔内2滴(约0.05毫升)。饮水免疫时，用冷开水、井水(忌用含氯等消毒剂对疫苗有害物质的水)将疫苗稀释。其稀释剂量根据鸡龄大小而定，使用疫苗剂量不论鸡龄大小，平均每只鸡饮用实含病毒量0.01毫升(克)。

5．疫苗加水稀释后，应放冷暗处，必须当天用完。

6．免疫后7～8天产生免疫力，免疫持续时间根据鸡体本身的免疫状态和日龄而不同。因此对鸡群免疫状态应进行监测。

(五)附记事项

参照“鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗制造”有关内容。

四、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗制造

(一)毒种

1．制造鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗的毒种，由中国兽药监察所鉴定保管和供应。 2．毒种必须符合以下标准：

(1)对鸡胚的毒务，绒毛尿囊膜上接种，最小感染量不低于10-5/0.2毫升。绒毛膜呈明显水肿增厚，并有灰白色豆斑，胎儿无肉眼可见病变。

(2)对鸡涂抹毛囊或刺种，最小发痘量不低于10-4。2～4月龄鸡涂抹毛囊，局部毛囊红肿、结痂(不融合)，涂部皮肤间有轻微水肿，2～3周康复，不引起全身痘及其他反应。刺种部位有硬肿、结痂，2～3周结痂应脱落。

(3)毒种用刺种法对鸡的最小免疫量不低于10-4。 (4)毒种须无菌。

3．毒种的继代：将无菌的毒种(绒毛尿囊膜)用生理盐水作成10-2或10-3悬液，以0.2毫升接种于11～12日龄鸡胚绒毛尿囊膜上，在35～37℃孵育，弃去死胚，将第五天活的鸡胚冷却致死，用无菌手术采取有明显病变的绒毛尿囊膜。

4．毒种的保存：

合乎上述标准的毒种，湿毒在-15℃以下不应超过1年；0～4℃不应超过2个月。冻干毒在-15℃以下保存不应超过6年；0～4℃不应超过1年。

(二)疫苗制造 1．制苗用鸡蛋宜采用受精率高，确为健康鸡群所生的蛋，经清除壳外的污物后，置38.5～39℃孵化，相对湿度最好为60～70%.

2．接种：选用11～12天胎儿发育良好的鸡胚，以10-2或10-3稀释的毒种0.2毫升接种于绒毛尿囊膜上，或以0.1毫升接种于尿囊内。接种后，将蛋壳的钻孔用蜡密封，置35～37℃继续孵育。

3．收获：接种后，每天检蛋1次，将4天前死胚剔出。第4、5天死亡的胚，经培养无菌、绒毛尿囊膜病变明显者亦可用于制苗。接种后第5天收获豆毒，活胚收获前先将鸡胚放冰箱冷却致死，用无菌手术取有水肿或有豆斑胚的整个绒毛尿囊膜，置灭菌容器内冻结保存。同时吸取尿囊液少许作无菌检验，并作鸡红细胞凝集试验，选无菌和无凝集现象的绒毛尿囊膜用于制苗。

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4．配制疫苗：

(1)甘油苗：将无菌的绒毛尿囊膜称重后，先加适量的50%甘油盐水磨碎，然后按含毒组织的重量补加50%的甘油盐水，使成1:100的悬液，并按每毫升加青霉素500单位和链霉素500微克，过滤即成疫苗。疫苗分装于灭菌瓶内，密封瓶口，粘贴瓶签注明疫苗批号、制造日期、装量等。

(2)冻干苗：将无菌的绒毛尿囊膜(有菌者另行组批)称重后根据具体情况决定加保护剂比例，先加入适量的5%蔗糖脱脂奶细磨，再按组织量计算应配苗量，补足余量的保护剂，每毫升疫苗加青霉素500～1000单位、链霉素500～1000微克，过滤分装，进行真空冻干，粘贴瓶签。

5．制造疫苗的所有过程，须详细记录于专用的表册中。 (三)疫苗的检验

1．无菌检验：按《成品检验的有关规定》进行。甘油苗需无菌生长。冻干苗如有菌生长，应作杂菌病原性鉴定及杂菌计数。

杂菌的病原性鉴定：除按《成品检验的有关规定》进行外，并做鸡白痢等沙门氏菌的检验，应为阴性。其检验方法见附记事项。

杂菌计数：按《成品检验的有关规定》进行，每克组织含杂菌数不应超过1000个。 2．安全检验：

(1)用1～2周龄未经鸡痘免疫且无鸡新城疫抗体的雏鸡5个，每胚尿囊内接种于10倍稀释疫苗0.2毫升，观察7～10日应健活。

(2)用确知未经鸡新城疫免疫鸡群所产蛋孵育的鸡胚5个，每胚尿囊内接种10倍稀释疫苗0.1～0.2毫升，观察120小时将死胚尿囊液混合；活胚分别收取尿囊液，作鸡红细胞凝集试验应为阴性。如血凝阴性，鸡胚死亡数在2/5(含2/5)以下，可判为安全。

3．效力检验：

(1)用鸡胚作效检：将疫苗用生理盐水按组织含量稀释成10～5，用11～12日鸡龄胚5个，分别接种0.2毫升于绒毛尿囊膜上。接种后96～120小时观察判定，全部鸡胚在绒毛尿囊膜上，应有水肿增厚或痘斑，疫苗判为合格。如不合格时，可重检1次。

(2)用鸡作效检：将疫苗按组织含量用生理盐水稀释成10～4，用2～12龄月鸡3只，分别于翅膀内侧无血管处刺种1针，第4～6天刺肿部位发生痘肿则判为合格。

4．物理性状检验及留样：按《成品检验的有关规定》进行。所有检验过程及检验结果，均须详细记录于专用的表册中。

(四)疫苗的保存及使用

1．疫苗保存有效期自采毒日期算起：

(1)甘油苗：0～4℃保存不应超过2个月；25℃保存不应超过7天。

(2)冻干苗：-15℃以下保存不应超过18个月；0～4℃保存不超过12个月；25℃保存不超过1个月。

2．本疫苗对初生雏鸡(6日龄以上)及成鸡均可使用。

3．疫苗按实含组织量用50%甘油盐水或生理盐水稀释100倍或200倍摇匀后应用，稀释后当天用完。

4．用鸡痘刺种针或灭菌钢笔尖蘸取稀释的疫苗，于鸡翅内侧无血管处皮下刺种。初生(6日龄以上)雏鸡用200倍稀释疫苗刺种一针；超过20日龄的雏鸡，用100倍稀释疫苗刺种一针；一月龄以上的鸡可用100倍稀释疫苗刺种二针；接种后3～4天，刺种部位微观红肿、结痂2～3天脱落。

5．免疫期：大鸡5个月；初生雏鸡2个月。 (五)附记事项

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1．鸡白痢等沙门氏菌的检验：

将被检物接种于普通肉汤和厌气肉肝汤培养基中，于37℃培养24～48小时，选其生长旺盛的好气、厌气培养液各1～2管(瓶)，分别用1～2个S·S琼脂平皿划线。置37℃培养18～24小时，挑选无色、半透明、边缘整齐、光滑稍隆起的小菌落与鸡白痢阳性血清作玻片凝集反应，在2分钟内出现凝集者即为阳性。如无可疑菌落，或菌落太小，不易辨认，可继续培养24小时，挑选可疑菌落；如仍无可疑菌落。可不必作凝集试验，即可判为阴性。

附S·S琼脂配方：

蛋白胨5克 牛肉膏5 克乳糖10克

琼脂25克 胆盐10克 0.5%中性红水溶液4.5毫升 枸椽酸钠10～14克 0.1%煌绿溶液0.33毫升 枸椽酸铁0.5克 蒸馏水1000毫升

五、氢氧化铝胶菌苗的制造

氢氧化铝胶的制备：

（1）浓氨水500毫升加蒸馏水4500毫升，装入带胶管的下口瓶内。①液

（2）硫酸铝钾1000克加蒸馏水10000毫升，加热到60℃，放入大盒内。②液 （3）将①液加入到②液中，慢加快搅，当①液剩约1000毫升时，停止加入，测PH（6～9左右）。

（4）静置弃上清，用蒸馏水洗3～4次，每次均静置弃上清。 （5）测PH，分装后再静置，弃上清，高压备用。

(二)菌苗制造

1．制苗的培养基为普通肉汤，制法见《规程》附录(4)。

2．种子培养：制造种子用的各菌株，可按(三)条1项规定选典型菌落三个以上，接种普通肉汤，37℃培养24小时，经检验纯粹，即可作为种子使用。

3．菌液培养：

将菌种接种于普通肉汤，培养24小时后，进行大量扩增菌液至所需量。

4．纯检及杀菌：培养完成后的菌液，取样数菌作为参考，并作纯粹检验，取样后，加入0.1%甲醛液(按含量40%折算)37℃杀菌24小时。

5．加氢氧化铝胶及无菌检验：每5份菌液加入经灭菌的氢氧化铝胶1份(铝胶应符合附录(3)所规定的标准)，及1/1.5万～1/3万硫柳汞，振荡均匀使其充分混合，取样作无菌检验，(也可于菌液加铝胶后，再加杀菌剂及防腐剂)。

无菌检验方法：每瓶或每缸应取样接种普通平板培养基，放37℃培养1～2天，应无菌生长。

6．分装：经无菌检验后的菌苗即可进行分装，在分装过程中，随时搅拌使其混合均匀，分装后的菌苗应放冷暗处保存，并通知监察室抽检，每瓶菌苗应有瓶签，注明菌苗名称、批准文号、批号、装量、用法、制造日期、保存方法、有效期、检验号及厂名等。

7．每批菌苗的制造过程，应详细记载于专用的表册中。 (三)菌苗检验

1．无菌检验：按《成品检验有关规定》进行。

2．安全检验：用4～12个月龄健康鸡2只，各肌肉注射菌苗4毫升，观察10天，均应健活。

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3．效力检验：选用4～12个月龄健康鸡(鸭)4只，各肌肉注射菌苗2毫升，经14～21天后，与同条件对照鸡(鸭)2只，各肌肉注射致死量A型多杀性巴氏杆菌强毒菌液，观察10～14天，如对照全死，免疫组保护2～4只以上，判为合格。

(四)菌苗的保存和使用

1．保存期：从加甲醛溶液杀菌日算起，保存于2～15℃有效期为1年；保存于28℃以下阴暗处，有效期为9个月。

2．用量：两个月龄以上的鸡或鸭均可使用，每只肌肉注射2毫升，但用鸭效力检验通过者，只能用于鸭。

在有条件的地区，可于第一次注射后8～10天再注射次，免疫效果较好。

六、灭活脏器组织苗的制造

1．材料物品：含有0.4%甲醛的生理盐水，病死畜的肝、脾、肺、肾，高速组织捣碎机，灭菌漏斗、下口瓶、80目分样筛或纱布，2000毫升烧杯等。

2．甲醛生理盐水的配制：先将生理盐水高压消毒，然后每1000毫升生理盐水中加入甲醛原液10～12毫升。

3．疫苗制造：将病料称重(每次200克)，放入捣碎机内，加入甲醛生理盐水200毫升，高速捣碎2～3分钟，倒入2000毫升的烧杯内，补加甲醛生理盐水1600毫升。混匀后倒入带有分样筛或四层灭菌纱布的漏斗中，漏斗下接一个5000-10000毫升的下口瓶，边过滤边搅。滤完后将盛有滤液的下口瓶密封并放入37℃温箱灭活24～28小时，每2～3小时摇动一次。灭活完毕即可分装，室温保存，保存期半年。

4．疫苗检验：成品疫苗应为暗红色或灰褐色，有松散、微细沉淀，轻摇即散。用未经免疫健康成年动物2只，每只肌肉注射疫苗2毫升。注射后5天内动物应无任何反应。另将疫苗分别接种普通琼脂培养基、肉汤培养基和厌氧培养基，37℃培养24～72小时后应无细菌生长。

5．疫苗的使用：2月龄左右的幼大动物每只皮下或肌肉注射1～3毫升，成年动物每只注射3～5毫升。注射后15～20天产生免疫力，免疫期半年左右。

七、油乳剂灭活疫苗的制备

油乳剂灭活疫苗是灭活苗(也叫死苗)的一种，它主要是以矿物油(工业用10号白油，若用石蜡油更佳)作为佐剂，制备成油包水型的灭活苗。这种苗的抗原是以小溶液滴的形式包裹在油滴中，用油包裹液相抗原的过程叫做乳化，油相将抗原水相包裹后形成乳白色的乳悬液，因此叫做油乳剂苗。这种苗的优点是抗原进入体内后缓慢释放，因而能够较长时间刺激机体免疫系统，起到抗原库的作用，所以免疫效果好，免疫保护力持续时间长。其缺点是由于疫苗含有油佐剂，因此对机体有一定的刺激，有时甚至在注射局部会发生严重炎症反应。另外，由于疫苗吸收慢，对临近屠宰期的动物可能会影响到屠宰后的胴体品质。

1．油相的准备 取一定量的10号白油(以杭州产白油为最佳原料)，加入6%司本-80，2%硬脂酸铝140℃煮沸约1小时，或121℃高压30分钟备用。

2．抗原水相的准备 取制苗所用的灭活抗原若干。加入4%吐温-80，充分溶解后备用。 3．乳化 油相与抗原水相的比例按2～3:1计算，先将油相加入搅拌器或胶体磨，然后加入抗原水相，高速搅拌乳化3分钟。

4．分装及检验 乳化完毕即可分装。留取一定样品进行生物制品的三大检验：安全检验、无菌检验、效力检验(详见有关内容)。

5．注意事项 (1)整个制苗过程应严格无菌操作。(2)乳化不好的疫苗会很快分层，也就是油相和水相分离，叫做“破乳”。破乳的疫苗其免疫效果大大降低，不可使用。(3)注射动

物后局部有严重炎症反应甚至溃烂的疫苗严禁使用。

八、猪瘟兔化弱毒苗的制备：

用疫苗种毒接种健康家兔后，取有典型体温反应的接种家兔的血、脾、淋巴结（在发热期采取、如是全血要加抗凝剂，而且不用稀释可直接用），研磨，作1:100稀释，无菌过滤，每头猪不论大小均皮下或肌肉注射1毫升，免疫期1年，现用现制，若低温（－20℃）可保存2～3年不能反复冻融，每只成年兔的组织制成苗后大约可供200～300头猪免疫用。

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第四部分 抗备技术

一、抗法氏囊病高免卵黄抗体的制备

1．法氏囊病高免蛋的获得 用法氏囊弱毒疫苗10羽份饮水免疫产蛋鸡，同时用法氏囊组织灭活疫苗免疫，每只鸡0.5毫升。1周后每只鸡再注射囊组织灭活苗1毫升。末次注射后3周收集鸡蛋，测定卵黄中抗法氏囊病毒的抗体水平，当其琼扩抗体水平达到1:以上时，即可作为法氏囊病高免鸡蛋收集后备用。

2．高免卵黄的制备 将所收集的高免蛋在0.1%新吉尔灭中浸泡5～10分钟后捞出，敲破蛋壳，去净蛋清，将卵黄放入高速匀浆机中匀浆1分钟，然后用灭菌生理盐水作1:2稀释，加入万分之一的硫柳汞，混匀，分装。

3．检验 制备好的高免卵黄应留取样品作无菌检验、安检及效力检验。 4．应用 发病早期每只鸡注射1毫升，有良好疗效。也可用于紧急预防。

5．注意事项 整个操作过程应严格无菌。卵黄使用时应加入青、链霉素各1000单位/毫升。

二、抗新城疫高免血清的制备

1．鸡群的免疫 选取将近淘汰的成年鸡群，用新城疫Ⅰ系疫苗肌肉注射免疫，每只鸡2～3羽份。同时注射新城疫油乳剂灭活疫苗0.1毫升。免疫后14天测定期HI抗体。当HI抗体水平达到10log2以上时，即可准备采血制备高免血清。

2．高免血清的制备 将经过高度免疫的淘汰鸡无菌心脏采血或颈部放血，收入血清瓶中，放37℃2小时，再移入4℃4～12小时。在大容量离心机上2000rpm离心20分钟，无菌收集血清，56℃灭活30分钟，加入万分之一的柳硫汞后分装即可。

3．产品检验 对制备的血清应留取样品进行菌检、安检和效检，合格者方可使用。 4．应用 新城疫发病早期每只鸡肌肉注射1毫升有较好的效果。 5．注意事项 高免血清的制备过程要严格无菌操作，严防污染。

三、猪瘟高免血清的制备

1．猪群的免疫 选取健康的、屠宰前一个月的育肥猪，用猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫，每头猪肌肉注射疫苗5头份。一周后每头猪再注射10头份。末次注苗后2周用间接血凝试验测定免疫猪的抗体水平。当间接血凝抗体水平达到1:256以上时，便可采血制备高免血清。

2．血清的收集及制备 将免疫猪颈部消毒后放血，使血液流入灭菌容器中，放37℃2～3小时，再入4℃6～12小时。待血清完全析出后收集血清，并在大容量离心机上2000rpm离心20分钟，去除红细胞，再56℃灭活30分钟，加入柳硫汞后分装即可。

3．产品检验 制备的高免血清应进行菌检、安检和效检。

4．应用 使用前加入青、链霉素(各1000单位/毫升)，放至室温，发病早期每头猪肌肉注射15～40毫升。也可用于紧急预防。

5．注意事项 血清制备过程中要严格无菌操作。注射时防止通过针头，人为地将病毒由发病猪传染给未感染猪。

四、抗体提纯技术

(一)硫酸铵盐析法

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原理

硫酸铵是一种中性盐，当加至蛋白溶液中时，由于其脱水作用和电离后的离子中和作用，可使蛋白质脱水和表面电势下降，从而发生凝集和沉淀。硫酸铵的离子强度不同，被沉淀的蛋白质也不同。33～50%饱和度硫酸铵可使大部分免疫球蛋白沉淀。

试剂

取(NH4)2SO4(AR)800克，加至70～80℃热蒸馏水1000毫升中，搅拌使其大部分溶解。室温过夜后，上清液即为饱和硫酸铵溶液。必要时可用浓氨水或6mol/L硫酸调至所需PH。

操作

自血清中提取γ球蛋白时，可用50%饱和度硫酸盐析一次，也可先用50%饱和度，再用33%饱和度硫酸铵盐析。方法为将1份血清加1份生理盐水，在搅拌下滴加2份饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2小时后，2000r/min离心20分钟，吸弃上清液。如需再用33%. 饱和度硫酸铵盐析，可取饱和硫酸铵溶液1份，加蒸馏水2份，配成33%饱和度溶液，加至上述盐析后的沉淀中，加入量约为沉淀物体积的20倍。充分搅拌混匀后于4℃静置2小时，同法离心，弃上清液。重复上述操作一次(即用33%饱和度硫酸铵处理2次)。将沉淀物溶于2倍体积的生理盐水中，置透析袋(或玻璃纸袋)中对生理盐水透析，多次更换生理盐水，至铵离子除尽为止(可用纳氏试剂测定)，即为γ球蛋白组分。

附注 1．用硫酸铵盐析时，蛋白质浓度对盐析效果影响较大。一般需先稀释至25.0～30.0g/L。 2．加饱和硫酸铵溶液时，应在搅拌下缓慢滴入，以防局部硫酸铵浓度过高，引起其他无关蛋白的共沉。只有在溶液中蛋白含量<10.0g/L时，方可一次将硫酸铵溶液加入。

3．加硫酸铵后，应于4℃静置数小时或过夜，以便蛋白质充分沉淀。 (二)辛酸法 原理

此法是利辛酸(一种短链脂肪酸)在酸性条件下可使绝大部分血浆蛋白和α、β区带的球蛋白成分沉淀，而免疫球蛋白仍保留在上清液中。将上清液PH调至偏碱性后，再加入硫酸铵，使达45%饱和度，即可将免疫球蛋白沉淀。

试剂

1． 0.06mol/L，PH4.0醋酸盐缓冲液： 0.06mol/L醋酸钠(醋酸钠4.92g/L180ml 0.06mol/L醋酸(冰醋酸3.44mol/L)820ml 两液混合即成。

2．1.0mol/L与0.1mol/LNaOH:

NaOH40g溶于蒸馏水中并补足水至1000毫升，即为1.0 mol/L NaOH。取1.0mol/L NaOH 1份加蒸馏水9份即为0.1mol/L NaOH。

3．10倍浓缩磷酸盐缓冲液(10×PBS) NaCl 80.0g KCl 20.g

Na2HPO4 11.5g KH2PO4 2.0g

0.1mol/L EDTA 20ml

蒸馏水溶解后补足水至1000毫升，PH7.4。 4．辛酸。 操作 1．血清或腹水(单克隆抗体)1份加0.06mol/L PH4.0醋酸盐缓冲液4份，用0.1mol/L NaOH

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调PH至4.5。

2．搅拌下每毫升稀释样品缓慢滴加辛酸25微升，继续搅拌30分钟后10000×g离心30分钟，除去不溶物(白蛋白等)。

3．上清9份加10×PBS 1份，用1.0mol/LnaOH调PH至7.4。冰浴冷至4℃。 4．每毫升加硫酸铵0.277克，搅拌30分钟后5000×g离心15分钟。吸弃上清，用1/10原血清(腹水)量的PBS溶解沉淀物。对50～100容各的PBS透析，多次更换PBS，至透析液中无铵离子为止。

5．将上述透析后的样品量50～55℃水浴加热20分钟，再5000×g离心20分钟。上清即为提取的免疫球蛋白。

附注

1．加辛酸前样品应适当稀释(以1份样品加4份醋酸缓冲液为好)，否则在加辛酸后白蛋白与α、β球蛋白不能被完全沉淀。

2．PH对辛酸沉淀蛋白的效果有很大影响。PH4.2和4.5时，杂蛋白可被完全沉淀；PH4.8时，某些α、β蛋白不被沉淀；PH5.1时白蛋白也不能完全沉淀；PH过低，免疫球蛋白得率会显著下降。

3．辛酸浓度<20ul/ml或>30ul/ml均会引起杂蛋白的沉淀不完全，故推荐用25ul/ml。但如样品(稀释后)总量<5ml时，则以30ul/ml为好。

(三)DEAE-纤维素批量法 原理

DEAE-纤维素是一种阴离子交换剂。当蛋白质溶液的PH高于蛋白质的等电点时，蛋白

-质带负电荷，蛋白质分子中的羧基阴离子与DEAE-纤维素的相应离子“Cl”交换，被吸附到交换剂上。这种吸附是通过静电键实现的。不同蛋白质的分子大小、荷电状态不同，与交换剂结合的紧密程度也不同。改变缓冲液的离子强度或PH可使这种结合状态改变(解吸附)。不同蛋白质的解吸条件是不同的，故可达到对某种蛋白质分离纯化的目的。用此法可自血清中提取较纯的IgG。

试剂

1．0.5mol/L NaOH

NaOH20.0g溶于蒸馏水后补足水至1000ml 2．0.5mol/L HCl

浓HCl42ml，加蒸馏水至1000ml。 3．0.01 mol/L，PH7.4磷酸缓冲液(PB) Na2HPO4·12H2O14.51g NaH2PO4·2H2O1.48g

溶于蒸馏水后补足水至5000ml。 4．DEAE-纤维素(以DE-32为例)

将DE-32用0.5 mol/L NaOH反复浸泡至上清液不再呈黄色，换蒸馏水浸泡至近中性。再用0.5 mol/L HCl浸洗2次。倾去HCl 后用蒸馏水浸洗DE-32，至上清液PH与水同。再用0.5 mol/LnaOH浸洗一次，用蒸馏水洗至近中性。用0.01 mol/L PH7.4PB反复浸泡平衡后尽可能滤除水份(以上过程可在铺有滤纸的布氏漏斗内用减压抽滤的方法进行)。

操作

血清1份，加蒸馏水2份，混匀。按每毫升原血清用8～10g湿重的DE-32，将稀释血清加至处理好并滤干的DE-32中，充分混匀。4℃室温1小时(其间可搅匀2～3次)后，倾至铺于布氏漏斗中的滤纸上，减压抽滤，滤液即为IgG。再用少量0.01 mol/L PH7.4PB洗滤一次，两次洗滤液合并，加入适量80.0g/L NaCl使成等渗。

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附注

1．DEAE-纤维素的处理应严格，特别是最后用0.01 mol/L PH7.4PB浸泡平衡这一步。 2．DEAE-纤维素与血清的比例对提取的IgG纯度影响甚大。DEAE-纤维素量不足，提取的IgG中杂蛋白含量显著增多。

3．用于提取IgG的血清，必须预先稀释，否则也会使提取物不纯。

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