一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒[

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112111597 A(43)申请公布日 2020.12.22

(21)申请号 202010351155.5(22)申请日 2020.04.28

(71)申请人 安徽同科生物科技有限公司

地址 237000 安徽省六安市金寨县现代产

业园区金梧桐创业园A7楼(72)发明人 陈林峰　季琳　宋冬梅　(74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限

公司 31253

代理人 辇甲武(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12R 1/93(2006.01)

权利要求书2页 说明书9页序列表1页 附图7页

(54)发明名称

一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒

(57)摘要

本发明提供一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒的试剂盒，包括：Direct RT‑PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照。本发明增加了寡核苷酸探针Block，有效封闭同源性较高的冠状病毒SARSr‑CoV对检测准确性的影响，使检测的准确性更高。

CN 112111597 ACN 112111597 A

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1.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的实时荧光RT-PCR的引物和探针，其特征在于：

针对新型冠状病毒开放读码框1a/b和核壳蛋白设计上下游引物和探针，新型冠状病毒开放读码框1a/b和核壳蛋白的基因引物和探针序列如下：

新型冠状病毒开放读码框1a/b基因上游引物2019nCOV(ORF)-F：GCACGTGCTGGTAAAGCTTCA

新型冠状病毒开放读码框1a/b基因下游引物2019nCOV(ORF)-R：TTTAATTTCAAAAGGTGTCTGCAAT

新型冠状病毒开放读码框1a/b基因探针2019nCOV(ORF)-P：TTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCC

核壳蛋白基因上游引物2019nCOV(N)-F：TGTCTGATAATGGACCCCAAAAT

核壳蛋白基因下游引物2019nCOV(N)-R：CCGACGTTGTTTTGATCGC

核壳蛋白基因探针2019nCOV(N)-P：ACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAA。

2.一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：针对封闭SARSr-CoV序列的特异序列的探针命名为Block，其3’端进行磷酸化修饰，Block的序列如下：

SARS(ORF)-B：GCACGCGCGGGCAAGTCAATG-PO4SARS(N)-B：TGTCTGATAATGGACCCCAATCG-PO4。

3.一种免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括：

Direct RT-PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照，所述Direct RT-PCR反应液包括0.8-1.2％Tween20、0.7-0.9％聚乙二醇辛基苯基醚、20mM-50mM NaOH、0.3-0.6％PEG8000、4-5mM氯化镁、10-30mM Tris-HCl(PH 8.2)、30-50mM KCl、10-20mM硫酸铵、0.1-0.3mg/mL小牛血清白蛋白、200μM-400μM dATP、200μM-400μM dGTP、200μM-400μM dCTP、100μM-200μM dTTP、100μM-200μM dUTP、0.1-0.3μM的引物(2019nCOV(ORF)-F、2019nCOV(ORF)-R、2019nCOV(N)-F、2019nCOV(N)-R、HBB-F、HBB-R)、0.1-0.2μM的探针(2019nCOV(ORF)-P、2019nCOV(N)-P、HBB-P)、0.3-0.5μM的Block(SARS(ORF)-B、SARS(N)-B)和DEPC水。

4.如权利要求3所述的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于：

所述酶混合液包括2-5U/μL的热启动Taq酶、20-40U/μL的逆转录酶、1-2U/μL的热敏感UDG酶、25-40U/μL的RNA酶抑制剂。

5.如权利要求3所述的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于：

所述阴性对照为灭菌生理盐水。

6.如权利要求3所述的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR

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试剂盒，其特征在于：

所述阳性对照为103拷贝/uL的含有新型冠状病毒2019-nCoV核酸中新型冠状病毒开放读码框1a/b基因、核壳蛋白基因和内标β珠蛋白基因的RNA序列的假病毒。

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一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧

光PCR试剂盒

技术领域

[0001]本发明涉及一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒，属于生物检测领域。背景技术

[0002]冠状病毒(Coronaviruses，CoV)为不分截断的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)，新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。其临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重型病例多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。

[0003]目前依据新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)新型冠状病毒2019-nCoV的确诊为疑似病例具备以下病原学或血清学证据之一者：1.实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性。2.病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。3.血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。实时荧光RT-PCR检测技术融合了PCR 技术具有特异性高、灵敏度高、快速准确、闭管操作能有效消除核酸交叉污染的明显优势，其应用越来越广泛，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得检测结果。[0004]实时荧光RT-PCR扩增的产物为核酸片段，而病毒冠状病毒的核酸都是包裹在蛋白衣壳内，且病毒存在于成分复杂的临床样本中，因此在扩增前需要对临床样本进行处理，将核酸释放并纯化出来后才能进行核酸扩增。现阶段对样本的核酸进行提取，主要采用离心柱法和磁珠法，两种方法都要经过裂解、结合、洗涤、漂洗、洗脱等步骤，操作复杂，耗时长，且需要用到大量的蛋白变构剂和有机溶剂。样本提取容易引起样本间的交叉污染，造成假阳性，同时核酸提取还需用到专业的实验室设备及环境，对操作人员也有特殊的要求。[0005]通过基因比对发现新型冠状病毒2019-nCoV基因组序列与 SARSr-CoV高度同源，亟需发明一种能够有效区分二者，准确检出新型冠状病毒2019-nCoV核酸的实时荧光RT-PCR的方法。[0006]所以，为了满足新型冠状病毒2019-nCoV临床快速检测需求，亟需发明一种能够提高检测准确性且操作要求低的直接扩增实时荧光 RT-PCR试剂盒。发明内容

[0007]本发明的目的在于提供一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒 2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒，从而达到提高检测准确性且操作要求低的效果。[0008]本发明采用了如下技术方案：

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本发明提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的实时荧光 RT-PCR的引物和

探针，其特征在于：

[0010]针对新型冠状病毒开放读码框1a/b和核壳蛋白设计上下游引物和探针，新型冠状病毒开放读码框1a/b和核壳蛋白的基因引物和探针序列如下：

[0011]新型冠状病毒开放读码框1a/b基因上游引物2019nCOV(ORF)-F： GCACGTGCTGGTAAAGCTTCA

[0012]新型冠状病毒开放读码框1a/b基因下游引物2019nCOV(ORF)-R： TTTAATTTCAAAAGGTGTCTGCAAT

[0013]新型冠状病毒开放读码框1a/b基因探针2019nCOV(ORF)-P： TTATTGACACTAAGAGGGGTGTATACTGCTGCC

[0014]核壳蛋白基因上游引物2019nCOV(N)-F：[0015]TGTCTGATAATGGACCCCAAAAT

[0016]核壳蛋白基因下游引物2019nCOV(N)-R：[0017]CCGACGTTGTTTTGATCGC

[0018]核壳蛋白基因探针2019nCOV(N)-P：[0019]ACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAA。

[0020]本发明还提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的实时荧光 RT-PCR方法，其特征在于：针对封闭SARSr-CoV序列的特异序列的探针命名为Block，其3’端进行磷酸化修饰，Block的序列针对SARSr-CoV 序列中与新型冠状病毒2019-nCoV待检区域高度同源部分，Block的序列如下：[0021]SARS(ORF)-B：GCACGCGCGGGCAAGTCAATG-PO4[0022]SARS(N)-B：TGTCTGATAATGGACCCCAATCG-PO4。

[0023]本发明还提供一种免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括：[0024]Direct RT-PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照，[0025]所述Direct RT-PCR反应液包括0.8-1.2％Tween20、0.7-0.9％聚乙二醇辛基苯基醚、20mM-50mM NaOH、0.3-0.6％PEG8000、4-5mM氯化镁、10-30mM Tris-HCl(PH 8.2)、30-50mM KCl、10-20mM硫酸铵、 0.1-0.3mg/mL小牛血清白蛋白、200μM-400μM dATP、200μM-400μM dGTP、200μM-400μM dCTP、100μM-200μM dTTP、100μM-200μM dUTP、 0.1-0.3μM的引物(2019nCOV(ORF)-F、2019nCOV(ORF)-R、 2019nCOV(N)-F、2019nCOV(N)-R、HBB-F、HBB-R)、0.1-0.2μM的探针(2019nCOV(ORF)-P、2019nCOV(N)-P、HBB-P)、0.3-0.5μM的Block (SARS(ORF)-B、SARS(N)-B)和DEPC水。[0026]进一步，本发明的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，还具有这样的特征：所述酶混合液包括2-5U/μL 的热启动Taq酶、20-40U/μL的逆转录酶、1-2U/μL的热敏感UDG酶、 25-40U/μL的RNA酶抑制剂。[0027]进一步，本发明的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR试剂盒，还具有这样的特征：

[0028]所述阴性对照为灭菌生理盐水。[0029]进一步，本发明的免核酸提取的检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光RT-PCR

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试剂盒，还具有这样的特征：

[0030]所述阳性对照为103拷贝/uL的含有新型冠状病毒2019-nCoV核酸中新型冠状病毒开放读码框1a/b基因、核壳蛋白基因和内标β珠蛋白基因的RNA序列的假病毒。[0031]与现有新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒相比，本发明具有以下优势：[0032](1)本发明增加了寡核苷酸探针Block，有效封闭同源性较高的冠状病毒SARSr-CoV对检测准确性的影响，使检测的准确性更高。[0033](2)本发明优化了实时RT-PCR检测流程，免去核酸提取，能显著提高RT-PCR检测的效率。降低RT-PCR检测成本，具有较高的经济效益。[0034](3)本发明提供了一种准确性高且操作要求低的直接扩增实时荧光 RT-PCR试剂盒，满足市场对新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测的需求。附图说明

[0035]图1A和图1B为Block工作原理图。[0036]图2显示试剂盒质控品的扩增曲线，其中图2A显示阳性对照在 RT-PCR反应液中的扩增曲线，图2B显示阴性对照在RT-PCR反应液中的扩增曲线，图2C显示内对照β珠蛋白基因在RT-PCR反应液中的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。

[0037]图3显示新型冠状病毒2019-nCoV阳性样本经过提取在RT-PCR反应液中的扩增曲线和不进行提取直接进行加样的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。其中，图3A是内标基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图3B是2019n-CoV病毒ORFlab基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图3C是2019n-CoV病毒N基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。

[0038]图4显示新型冠状病毒2019-nCoV阴性样本经过提取在RT-PCR反应液中的扩增曲线和不进行提取直接进行加样的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。其中图4A是内标基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图4B是2019n-CoV 病毒ORFlab基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图4C是2019n-CoV病毒N基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。

[0039]图5显示加Block检测SARSr-CoV阳性且新型冠状病毒2019n-CoV 阴性的样本和不添加Block检测SARSr-CoV阳性且新型冠状病毒 2019n-CoV阴性的样本。图5A是内标基因在添加Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。图5B是2019n-CoV病毒ORFlab基因在添加 Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。图5C是2019n-CoV病毒 N基因在添加Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。

具体实施方式

[0040]以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。

[0041]实施例一：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的组成[0042]新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒组成见表1。

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表1：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒组成

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其中，Direct RT-PCR反应液各组分终浓度为1％Tween20、0.8％聚乙二醇辛基苯

基醚、50mM NaOH、0.5％PEG8000、4mM氯化镁、20mM Tris-HCl(PH 8.2)、40mM KCl、20mM硫酸铵、0.3mg/mL小牛血清白蛋白、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dCTP、100μM dTTP、100μM dUTP、0.2μM的引物(2019nCOV(ORF)-F、2019nCOV(ORF)-R、 2019nCOV(N)-F、2019nCOV(N)-R、HBB-F、HBB-R)、0.1μM的探针 (2019nCOV(ORF)-P、2019nCOV(N)-P、HBB-P)、0.4μM的Block (SARS(ORF)-B、SARS(N)-B)和DEPC水。

[0046]Block的原理如图1A和图1B所示：Block的作用是封闭SARSr-CoV 序列，组织其逆转录。起封闭作用的特异序列的探针命名为Block，其3’端进行磷酸化修饰，Block的序列针对SARSr-CoV序列中与新型冠状病毒2019-nCoV待检区域高度同源部分，Block的序列如下：[0047]SARS(ORF)-B：GCACGCGCGGGCAAGTCAATG-PO4[0048]SARS(N)-B：TGTCTGATAATGGACCCCAATCG-PO4。[0049]酶混合液为3U/μL的热启动Taq酶、30U/μL的逆转录酶、1.5U/μL 的热敏感UDG酶、36U/μL的RNA酶抑制剂。[0050]其中，阴性对照为灭菌生理盐水。[0051]其中，阳性对照为103拷贝/uL的含有新型冠状病毒2019-nCoV核酸中ORF1ab基因、N基因和内标β珠蛋白基因的RNA序列的假病毒，灭菌生理盐水。[0052]图2显示试剂盒质控品的扩增曲线，其中图2A显示阳性对照在 RT-PCR反应液中的扩增曲线，图2B显示阴性对照在RT-PCR反应液中的扩增曲线，图2C显示内对照β珠蛋白基因在RT-PCR反应液中的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。[0053]实施例二：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的应用

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(1)直扩RT-PCR检测

[0055]按照比例取Direct RT-PCR反应液和酶混合液(Direct RT-PCR反应液23.5μL/人份+酶混合液1.5μL/人份)，充分混匀后按25μL/管分装到 PCR反应管中，备用。分别向准备好RT-PCR反应液中加入5μL鼻咽拭子/痰液/支气管灌洗液/肺泡灌洗液，盖紧管盖如有气泡，可用手指弹击，去除气泡。5000转/分钟离心30秒至管壁无明显液珠。[0056](2)直扩RT-PCR扩增

[0057]将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阳性对照、阴性对照及待测样本，并设置样本名称。

[0058]荧光检测通道选择FAM/CY5/ROX。PCR反应循环参数设定见下表 2。[0059]表2：PCR反应参数

[0060]

(3)结果分析

[0062]反应结束后自动保存结果，对检测靶标及内参基因的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值及Threshold 值，Start值在3-15、End值设在5-20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线，对FAM/CY5/ROX分别观察线型和CT值进行记录。[0063]质量控制：阴性对照：FAM、ROX及内标(CY5)通道均无Ct值或Ct＞38。阳性对照：FAM、ROX及内标(CY5)通道均Ct≤38。以上要求均需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。[0064]结果判断：

[0065]先分析内标(CY5)是否有典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析。[0066](1)若FAM通道检测到典型S型扩增曲线，且Ct≤40，表示 2019-nCoV病毒ORF1ab基因为阳性。若FAM通道未检测到典型S型扩增曲线，表示2019-nCoV病毒ORF1ab基因为阴性。[0067](2)若ROX通道检测到典型S型扩增曲线，且Ct≤40，表示 2019-nCoV病毒N基因为

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阳性。若ROX通道未检测到典型S型扩增曲线，表示2019-nCoV病毒N基因为阴性。[0068](3)若内标在CY5通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本浓度太低或有干扰物抑制反应，需重新准备实验。[0069](4)对于阳性样本，内标检测结果不做要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性，若其内标检测为阴性，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。[0070](5)只有当2019-nCoV病毒ORF1ab基因和2019-nCoV病毒N基因均为阳性时，判定为2019-nCoV病毒阳性。

[0071]图3显示新型冠状病毒2019-nCoV阳性样本经过提取在RT-PCR反应液中的扩增曲线和不进行提取直接进行加样的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。其中，图3A是内标基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图3B是 2019n-CoV病毒ORFlab基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图3C是2019n-CoV病毒N基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。

[0072]图4显示新型冠状病毒2019-nCoV阴性样本经过提取在RT-PCR反应液中的扩增曲线和不进行提取直接进行加样的扩增曲线，其中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。其中图4A是内标基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图4B是2019n-CoV 病毒ORFlab基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。图4C是2019n-CoV病毒N基因在使用磁珠法提取后检测和本发明的免提取直接检测的检测曲线。

[0073]图5显示加Block检测SARSr-CoV阳性且新型冠状病毒2019n-CoV 阴性的样本和不添加Block检测SARSr-CoV阳性且新型冠状病毒 2019n-CoV阴性的样本。图5A是内标基因在添加Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。图5B是2019n-CoV病毒ORFlab基因在添加Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。图5C是2019n-CoV病毒 N基因在添加Block后检测和不添加Block进行检测的曲线。

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序列表<110> 安徽同科生物科技有限公司<120> 一种免核酸提取快速检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的荧光PCR试剂盒<130> JSP12001134<160> 8<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

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图1A

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