病毒中和抗体检测
1. 病毒TCID50检测
TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示
的是计量，不是浓度； 2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。
首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为ml 。它表示的是每ml病毒溶液里含有个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为L表示每L溶液中含有个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10TCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是。
TCID50=10^。即：将病毒悬液作10^稀释后，接种细胞，可以使50%的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10^稀释后，中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/或者100TCID50/）
本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用头吸出细胞生长液时,容易出现污染;
使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换头,减少浓度误差;
②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;
维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3; ②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.
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1） 细胞准备
检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞
放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min） 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数
以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml ×10^5/ml
在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于×10^4细胞/孔 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定
2） 病毒制备
3） 病毒稀释
取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。（于 EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！） 做10倍稀释
在另一新 EP管中加入100μl第一管稀释病毒液（1/10），按10的比例进行倍比稀释，再加入900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至10^13倍。
此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）
4） 病毒接种：
取细胞培养板，用多道加样器（又称排）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。 于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。 (病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13) 第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CON CON A B C D E F G H 37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续于37℃，5% CO2培养5--10天；
逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE（cytopathic effects，CPEs）的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效； 计算每一列中出现阳性的孔数；
用Reed-Muench法计算病毒TCID50/ml。
(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2） (2)计算阳性和阴性孔的累积数。
阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）
(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100
(4)计算
距离比例（PD）=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比）
TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数
（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为，倍比稀释为，1:5稀释为）
举例计算：TCID50的测定和计算（Reed-Muench法） 病毒液稀释度 10 10 10 10 10 10 -6-5-4-3-2-1细胞管观察结果 出现CPE管 8 8 7 3 1 0 不出现CPE管 0 0 1 5 7 8 累计细胞官数 出现CPE管 27 19 11 4 1 0 不出现CPE管 0 0 1 6 13 21 细胞管总数 27 19 12 10 14 21 出现CPE的细胞管所占的％ 100（27/27） 100(19/19) (11/12) 40(4/10) (1/14) 0(0/21) 出现细胞病变（CPE）以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第二和第三列,它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的TCID50在10-3（％）和10-4（40％）之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：
（高于50％的百分数）-50 （高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数） ＝＝
将由上式获得加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID50应是 稀释的病毒液。查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液等于1个TCID50。
2. 中和实验
1） 细胞准备
检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞
放平培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落
加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min） 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数
以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml ×10^5/ml
在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于×10^4细胞/孔 在37℃ 5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定
2）待测血清准备
动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。
取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:0，1:1280稀释，每个稀释度做3-4个平行孔。
3) 加入病毒,感作
以VGM将病毒稀释到100 TCID50/50μl (200 TCID50/100μ)
除细胞对照孔外每孔中加入与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中加入与血清量相等的VGM
轻混病毒－血清混和物，37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h
4）接种细胞
准备用于接种的刚达到完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，加入350μl无血清D-MEM培养液以洗掉剩下的FBS
病毒－血清混和物孵育2h结束后，各取100μl中和液到细胞培养板相应的孔中
37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h
吸掉中和液，加250μl D-MEM 洗涤 加200μl D-MEM 在37℃ 5％CO2培养箱中孵育3－4d，检测培养液中血凝活性，以能保护50％细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。
在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14D终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。
5）对照组
对照的设定：包括细胞对照（培养液中仅含细胞，不含病毒和血清），阴性对照（培养液中含有l00TCID50病毒、细胞及阴性血清）和空白对照（培养基中含有100TCID50病毒及细胞，不含血清），各设3个平行孔。
为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。 阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。
病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作、1、10、 100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。 TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。 血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。 正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。
6) 结果判定和计算
当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。
举例计算：用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，固定病毒－稀释血清法中和抗体效价计算 如表2-26
血清稀释 CPE数 无 积累CPE 积累无CPE CPE比率 百分数
1:4 0/4 0 4 0 12 0/12 0
1:8 0/4 0 4 0 8 0/8 0
1:16 1/4 1 3 1 4 1/5 20
1:32 3/4 3 1 4 1 4/5 80
1: 4/4 4 0 8 0 8/8 100
80%－50%
距离比例＝──────＝ 80%－20%
Ig TCID50=高于50％血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数 Ig TCID50＝－－×（－）＝－
（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为，倍比稀释为，1:5稀释为）
则TCID50＝，50μl
因=1/22，即1:22的血清可保护50％细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。
影响中和试验的因素：
(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用100-500 TCID50。
(2) 用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。 (3) 细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。
(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符
